DB15/T 1852-2020 动物毛尾线虫病检疫技术规范

ICS65.020.30

B41

DB15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T1852—2020

动物毛尾线虫病检疫技术规范

Quarantineprotocolfortrichuriasisinanimals

2020-02-25发布2020-03-25实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T1852—2020

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心、内蒙古自治

区农牧业科学院。

本标准主要起草人：赵治国、于志超、张晓东、陈林军、延涵、崔强、王海艳、敖威华、李军燕、

罗晓平。

I

DB15/T1852—2020

动物毛尾线虫病检疫技术规范

1范围

本标准规定了动物毛尾线虫病病原的形态学鉴定法、普通PCR检测法和实时荧光PCR检测法。

本标准适用于动物毛尾线虫病病原及虫卵的形态学鉴定和分子生物学诊断。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

毛尾线虫Trichuris

危害多种动物的重要的寄生虫之一，又称毛首线虫、鞭虫，属线形动物门（Nematomorpha）、线虫

纲（Nematode）、毛尾目（Trichurata）、毛尾科（Trichuridae）、毛尾属（Trichuris）。

注：虫体主要寄生于猪、牛、羊、骆驼等多种哺乳动物。由毛尾线虫引起的毛尾线虫病主要通过动物粪便中的毛尾

线虫虫卵污染食物和饮水而传播，亦可感染人。

3.2

聚合酶链式反应polymerasechainreaction(PCR)

用于扩增位于已知序列之间脱氧核糖核酸（deoxyribonucleosideaacid，DNA）的方法。

注：模板DNA经过高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分别于模板

DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribo

nucleosidetriphosphate，dNTP）为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这一循环，

使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增，经25～30个扩增循环，扩增倍数达到106。

3.3

实时荧光聚合酶链式反应real-timepolymerasechainreaction(real-timePCR)

在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，并通过标准曲线对

位置模板进行定量分析的方法。

注：荧光信号的强弱直接反映模板数量。

1

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3.4

Ct值cyclethreshold（Ct）

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

bp：碱基对basepair

DNA：脱氧核糖核酸deoxyribonuleicacid

FAM：6-羧基荧光素6-carboxyfluorescein

TAMRA：6-羧基四甲基罗丹明6-carboxytetramethylrhodamine

5试剂和材料

5.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。

5.2丙酮。

5.3蛋白酶K溶液：用双蒸水溶解为10mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存。

5.42%CTAB裂解液：称取2gCTAB，10mL1M的Tris-HCL（pH=8.0），4mL0.5M的EDTA（pH=8.0），

25mL5MNaCL，加双蒸水定容至100mL，高压蒸汽灭菌后，室温下放置待用。

5.50.5%SDS：称取0.5gSDS溶于100mL双蒸水中加热搅拌至完全溶解，室温下保存待用。

5.6酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）：量取250mL苯酚平衡液，240mL氯仿，10mL异戊醇，充分

混匀后，置于踪色瓶中，-4℃避光保存待用。

5.710%醋酸钠：称取1g醋酸钠，溶于100mL去离子水中，充分混匀后，室温下保存待用。

5.8饱食盐水：称取400gNaCL加热溶解于1000mL蒸馏水中，冷却待用。

5.9无水乙醇。

5.10TE缓冲液。

5.11PCRbuffer。

5.12dNTPs：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidine

triphosphate，脱氧胸腺三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dGTP

（deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸），2.5mmol/L。

5.13TaqDNA聚合酶（Taq,Thermusaquaticu，水生栖热菌）：-20℃保存，避免反复冻融或温度剧

烈变化。

5.14DNA分子量标准（DNAMarker）：50bp～500bp。

5.15琼脂糖：电泳纯。

5.16电泳缓冲液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LTE缓冲液（pH8.0）20mL，加蒸馏水至1000

mL；使用时10倍稀释。

5.17EB替代染料。

5.18实时荧光PCR预