WS/T 269-2019 布鲁氏菌病诊断

ICS11.020

C59

WS

中华人民共和国卫生行业标准

WS269—2019

代替WS269—2007

布鲁氏菌病诊断

Diagnosisforbrucellosis

2019-01-02发布2019-07-01实施

中华人民共和国国家卫生健康委员会发布

WS269—2019

前言

本标准第6章为强制性条款，其余为推荐性条款。

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准代替WS269—2007《布鲁氏菌病诊断标准》。

本标准与WS269—2007相比，主要技术变化如下：

——增加了规范性引用文件（见第2章）；

——增加了缩略语（见第3章）；

——增加了胶体金免疫层析试验（见4.3.1.2、附录C.2）；

——增加了酶联免疫吸附试验（见4.3.1.3、附录C.3）；

——增加了布鲁氏菌培养物涂片革兰染色检出疑似布鲁氏菌（见4.3.1.4）；

——修订了诊断原则，增加了临床诊断（见第5章和6.2）；

——增加了布鲁氏菌的培养，血培养仪培养布鲁氏菌的方法（见D.1和D.1.1）；

——修订了布鲁氏菌的培养中双相血培养瓶培养布鲁氏菌方法（见D.1.2）；

——修订了布鲁氏菌的培养中病理材料培养布鲁氏菌培养方法（见D.1.3）；

——增加了布鲁氏菌的鉴定及相关具体试验（见D.2）；

——增加了布鲁氏菌的核酸检测及BCSP31聚合酶链式反应（见D.2.5和D.2.5.1）；

——增加了AMOS聚合酶链式反应（见D.2.5.2）；

——增加了布鲁氏菌基因组DNA提取操作方法（见D.2.6）；

——增加了布鲁氏菌实验生物安全要求（见D.3）；

——删除了平板凝集试验（PAT）（见2007年版的C.1.1）；

——删除了皮肤过敏试验（见2007年版的C.2）；

——删除了布鲁氏菌培养的接种未受精鸡卵法（见2007年版的C.3.1.2）；

——删除了布鲁氏菌培养的尿液培养法（见2007年版的C.3.2）；

——删除了血培养的生物学分离布氏菌法（见2007年版的C.3.4）。

本标准起草单位：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、北京地坛医院、中国疾病预防控制中

心鼠疫布氏菌病预防控制基地、山西省疾病预防控制中心、辽宁省疾病预防控制中心、湖北省疾病预防

控制中心、内蒙古自治区综合疾病预防控制中心、杭州市疾病预防控制中心、青海省地方病预防控制所。

本标准主要起草人：崔步云、李兴旺、王大力、姜海、张秋香、毛玲玲、程均福、米景川、徐卫民、

徐立青、田国忠、刘熹。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

——WS269—2007。

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WS269—2019

布鲁氏菌病诊断

1范围

本标准规定了人间布鲁氏菌病的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。

本标准适用于全国各级各类医疗卫生机构及其医务人员对布鲁氏菌病的诊断。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定卫生部令第45号2005年

人间传染的病原微生物名录卫生部（卫科教发〔2006〕15号）

危险品航空安全运输技术细则国际民航组织（Doc9284号文件）

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CFT：补体结合试验（complementfixationtest）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

ELISA：酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay）

GICA：胶体金免疫层析试验（goldimmunochromatographyassay）

PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

RBT：虎红平板凝集试验（rosebengalplateagglutinationtest）

RTD：常规试验稀释度（routinetestdilution）

SAT：试管凝集试验（serumagglutinationtest）

4诊断依据

4.1流行病学史

发病前病人与疑似布鲁氏菌感染的家畜、畜产品有密切接触史，或生食过牛、羊乳及肉制品，或生

活在布鲁氏菌病疫区；或从事布鲁氏菌培养、检测或布鲁氏菌疫苗生产、使用等工作。其他流行病学参

见附录A。

4.2临床表现

4.2.1出现持续数日乃至数周发热（包括低热），多汗，乏力，肌肉和关节疼痛等。

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4.2.2部分患者淋巴结、肝、脾和睾丸肿大，少数患者可出现各种各样的皮疹和黄疸；急慢性期患者

可以表现为骨关节系统损害。具体临床表现参见附录B。

4.3实验室检查（实验方法见附录C、附录D）

4.3.1实验室初筛

4.3.1.1虎红平板凝集试验（RBT）结果为阳性。

4.3.1.2胶体金免疫层析试验（GICA）结果为阳性。

4.3.1.3酶联免疫吸附试验（ELISA）结果为阳性。

4.3.1.4布鲁氏菌培养物涂片革兰染色检出疑似布鲁氏菌。

4.3.2实验室确诊

4.3.2.1从病人血液、骨髓、其他体液及排泄物等任一种病理材料培养物中分离到布鲁氏菌。

4.3.2.2试管凝集试验（SAT）滴度为1:100++及以上，或者患者病程持续一年以上且仍有临床症状者

滴度为1:50++及以上。

4.3.2.3补体结合试验（CFT）滴度为1:10++及以上。

4.3.2.4抗人免疫球蛋白试验（Coomb’s）滴度为1:400++及以上。

5诊断原则

布鲁氏菌病的发生、发展和转归比较复杂，其临床表现多种多样，很难以某一种症状来确定诊断。

对布鲁氏菌病的诊断，应结合病人流行病学接触史、临床表现和实验室检查等情况综合判断。

6诊断

6.1疑似病例

符合4.1，并同时符合4.2。

6.2临床诊断病例

符合疑似病例并同时符合4.3.1中任一项。

6.3确诊病例

符合疑似或临床诊断病例并同时符合4.3.2中任一项。

6.4隐性感染

符合4.1，并同时符合4.3.2中任一项，且不符合4.2。

7鉴别诊断

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主要应与风湿热、伤寒、副伤寒、结核病、风湿性关节炎、脊柱炎、脑膜炎、睾丸炎等疾病鉴别诊

断,具体参见附录E。

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AA

附录A

（资料性附录）

布鲁氏菌病流行病学

A.1布鲁氏菌病

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属的细菌侵入机体，引起的人兽共患的传染-变态反应性疾病。

A.2贮存宿主及传染源

布鲁氏菌的贮存宿主很多，已知有60多种动物（家畜、家禽、野生动物、驯化动物）可以作为布鲁

氏菌贮存宿主。布鲁氏菌病往往先在家畜或野生动物中传播，随后波及人类，是人畜共患的传染病。疫

畜是布鲁氏菌病的主要传染源，我国大部分地区以羊作为主要传染源，有些地方牛是传染源，南方个别

省份的猪可作为传染源。鹿和犬等经济动物也可成为传染源。

A.3传播途径及传播因子

病原体可以通过体表皮肤黏膜、消化道、呼吸道侵入机体。人的感染途径与职业、饮食、生活习惯

有关。

含有布鲁氏菌的各种污染物及食物均可成为传播媒介，主要有病畜流产物、病畜的乳、肉、内脏，

被布鲁氏菌污染的皮毛、水、土壤、尘埃等。

A.4易感人群

人类对布鲁氏菌普遍易感。人群布鲁氏菌病感染率与传染源和传播媒介密切接触的机会、程度有关。

布鲁氏菌病患者可以重复感染布鲁氏菌。

A.5分布

A.5.1职业

有明显的职业性，凡与病畜、染菌畜产品接触多者发病率高。农民、牧民、兽医、皮毛和乳、肉加

工人员及相关实验人员感染率比一般人高。

A.5.2性别

人对布鲁氏菌易感，无性别差异，主要取决于接触机会多少。

A.5.3年龄

各年龄组均可感染发病。由于青壮年是主要劳动力，接触病畜频繁，因而感染率比其他年龄组高。

A.5.4季节

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一年四季各月均可发病。羊种布鲁氏菌流行区有明显的季节性高峰。我国北方农牧区人群发病高峰

在4月～5月，夏季剪羊毛和乳肉食品增多，也可出现一个小的发病高峰。牛种、猪种布鲁氏菌的布鲁氏

菌病季节性不明显。

A.5.5地区

布鲁氏菌病感染率在农牧区高于城镇，农牧区人与家畜接触频繁，感染机会多，城市病人则多集中

在一些皮毛乳肉加工企业。

A.6不同疫区的流行特点

A.6.1羊种布鲁氏菌疫区

羊种布鲁氏菌疫区的主要传染源是病羊。羊种布鲁氏菌1、2、3生物型对人、畜均有较强的侵袭力

和致病力，易引起人、畜间布鲁氏菌病暴发流行，疫情重。大多出现典型的临床症状和体征。

A.6.2牛种布鲁氏菌疫区

牛种布鲁氏菌疫区的主要传染源是病牛。牛种布鲁氏菌生物型较多，毒力不一。就总体而言，牛种

布鲁氏菌毒力较弱，但有较强的侵袭力，即使是弱毒株，也可使牛发生暴发性流产或不孕，严重影响畜

牧业发展。但对人致病较轻，感染率高而发病率低，呈散发性。临床症状和体征多不典型，病程短，后

遗症较少。

A.6.3猪种布鲁氏菌疫区

猪种布鲁氏菌疫区主要传染源是病猪。通常由猪种1型和猪种3型布鲁氏菌致病，毒力介于羊种布鲁

氏菌和牛种布鲁氏菌之间。同一生物型菌株，既有强毒株，也有弱毒株。猪种布鲁氏菌对猪致病力强，

对羊、牛致病力较弱。对人致病力比牛种布鲁氏菌强，除少数病例病情较重外，大多数无急性期临床表

现。

A.6.4犬种布鲁氏菌疫区

犬种布鲁氏菌疫区主要传染源是病犬。犬种布鲁氏菌除了侵袭犬，引起犬流产外，也可使猫、牛、

猪、兔、梅花鹿、鼠等动物感染，产生抗犬种布鲁氏菌抗体。人也可被感染，鲜有发病。

A.6.5混合型布鲁氏菌疫区

2种或2种以上布鲁氏菌同时在一个疫区存在，这与羊、牛同在一个牧场放牧或圈舍邻近有关。由于

彼此接触密切，不同菌种可以发生转移，从羊种布鲁氏菌转移到牛多见，也有羊种布鲁氏菌转移到猪；

猪种、牛种布鲁氏菌也可转移到羊。混合型疫区流行特点取决于当地存在的主要菌种。

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BB

附录B

（资料性附录）

布鲁氏菌病临床表现

B.1主要症状

B.1.1发热

是布鲁氏菌病常见的临床表现，典型病例表现为波状热，常伴有寒战等症状，可见于各期患者。部

分病例可表现为低热和不规则热型，且多发生在午后或夜间。

布鲁氏菌病患者在高热时神志清醒，痛苦较小，但体温下降时自觉症状加重，这种高热与病况相矛

盾的现象为布鲁氏菌病所特有。

B.1.2多汗

是布鲁氏菌病常见的临床表现，急性期病例出汗尤重，体温下降时加重，可湿透衣裤、被褥，使患

者感到紧张和烦躁。

B.1.3肌肉和关节疼痛

是布鲁氏菌病常见的临床表现，为全身肌肉和多发性、游走性大关节疼痛。一些病例还可有脊柱（腰

椎为主）骨关节受累，表现为疼痛、畸形和功能障碍等。

B.1.4乏力

几乎全部病例都有乏力疲劳的表现。

B.1.5其他

少数病例可有头痛、心、肾及神经系统受累的表现。

B.2主要体征

B.2.1肝、脾及淋巴结肿大

多见于急性期病例，肝、脾肿大的患者恢复较慢。

B.2.2其他

男性病例可伴有睾丸炎，女性病例可见卵巢炎。急性期患者可以出现各种各样的皮疹，一些患者可

以出现黄疸，慢性期患者表现为骨关节系统的损害。

B.3临床分期

B.3.1急性期

具有上述临床表现，病程在3个月以内，出现确诊的血清学阳性反应。

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B.3.2亚急性期

具有上述临床表现，病程在3个月～6个月之间，出现确诊的血清学阳性反应。

B.3.3慢性期

病程超过6个月仍未痊愈，有布鲁氏菌病的症状和体征，并出现确诊的血清学阳性反应。

B.4潜伏期

布鲁氏菌病的潜伏期一般为1周～3周。

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CC

附录C

（规范性附录）

布鲁氏菌病特异性实验室检查技术

C.1虎红平板凝集试验（RBT）

C.1.1器材与试剂

C.1.1.1器材：清洁玻片、微量加样器、木签、计时器。

C.1.1.2试剂：虎红平板凝集抗原、已知的阴性和阳性血清、待检血清。

C.1.2操作方法

在玻片上加30μL待检血清，然后加入虎红平板凝集抗原30μL，摇匀或用木签充分混匀，在5min

内观察结果。

每批次实验同时用阴性、阳性血清各一份作对照。

C.1.3结果判定

出现肉眼可见的凝集反应判为阳性；液体均匀混浊、未见到凝集反应判为阴性。

C.2胶体金免疫层析试验（GICA）

C.2.1器材及试剂

C.2.1.1器材：测试卡包被可溶性布鲁氏菌菌体抗原、人IgG的硝酸纤维素膜和胶体金标记结合物。0.1

mL吸管或微量加样器。

C.2.1.2试剂：生理盐水、待检血清。

C.2.2操作方法

在测试卡加样孔内加入10μL待检血清，待渗入。

在加样孔内加入生理盐水100μL，待渗入。3min～20min内观察结果。

C.2.3结果判定

测试卡质控区（C）显示红色线条，为此试验结果可信；未显示红色线条，此次试验失败。测试区

（T）显示红色线条，试验结果为阳性，只有质控区出现一条红色线条为阴性。

注：胶体金免疫层析试验可能有不同测试卡，实验方法可能有差别，具体实验参照说明书检测和作出实验诊断。

C.3酶联免疫吸附试验（ELISA）

C.3.1试剂盒及器材

C.3.1.1试剂盒组成

试剂盒组成详见表C.1。

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表C.1ELISA试剂盒组成

名称数量/单包装容量标码说明

标准A-D（1U/mL，10U/mL，40U/mL，150

U/mL）；即用标准A=阴性对照；标准B=临界

标准A-D4×2mLCALA-D

对照；标准C=弱阳性对照；标准D=阳性对

照

用含有抗人的IgG,结合过氧化物酶，蛋白缓

酶交联物IgG1×14mLENZCNJIgG

冲液，稳定剂

TMB底物液1×14mLTMBSUBS即用:内含TMB

TMB终止液1×14mLTMBSTOP即用:0.5MH2SO4

稀释液1×60mLDILBUF即用:含有PBSBSA＜0.1％NaN3

洗涤液1×60mLWASHBUFconc10倍浓缩，含有:PBS,Tween20

酶标板1×12孔×8孔MTP包被好特异性抗原

黏性覆膜2张FOIL在孵育时盖住酶标板

塑料袋1个BAG保存没有使用的黏性覆膜

C.3.1.2器材

酶标仪（吸收波长450nm，参考波长600nm～650nm）、洗板机、移液器、8道移液器、1mL移液

管、计时器、吸水纸巾、吸头、稀释板、加样槽、记号笔、双蒸馏水或去离子水。

C.3.1.3检测前准备

按照说明书配制洗涤液、稀释液。

按照说明书稀释待检血清。

C.3.2操作方法

步骤如下：

a)吸取100μL的各阴阳性对照液和稀释的样品，分别加入到相应酶标板孔中。

b)用黏性覆膜盖住酶标板，在18℃～25℃孵育60min。

c)移去覆膜，弃去酶标板液体。每孔加入稀释好的稀释液300μL,洗板3次，将板倒置在纸巾

上除去剩余液体。

d)使用移液器加入100μL酶交联物；取新的覆膜盖住酶标板，在18℃～25℃孵育30min；

e)重复C.3.2.c)。

f)使用移液器加底物液和终止液，加底物液和终止液的间隔时间应一样，加样时应避免产生气泡。

g)每孔加100μL的TMB底物液，取新的黏性覆膜盖住酶标板，在18℃～25℃孵育20min后，

每孔加入100μLTMB终止液终止酶促反应，轻荡酶标板使其混匀，颜色由蓝变黄为止。

h)在加入终止液的60min内，在450nm处检测吸光度。

C.3.3质量控制

C.3.3.1阴性、阳性标准品的OD值在质控要求的范围内。

C.3.3.2试验用仪器、加样器必需经