DB42/T 2215-2024 甘蓝型油菜品种真实性及其实质性派生品种MNP鉴定法

ICS65.020.01

CCSB05

DB42

湖北省地方标准

DB42/T2215—2024

甘蓝型油菜品种真实性及其实质性派生品

种MNP鉴定法

Rapeseedvarietiesauthenticityandessentialderivedvarieties—

MNPtestmethod

2024-03-26发布2024-05-26实施

湖北省市场监督管理局发布

DB42/T2215—2024

目次

前言................................................................................III

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4原理...............................................................................1

5试剂或材料.........................................................................2

6主要仪器设备.......................................................................2

7测定步骤...........................................................................2

8结果分析与判定.....................................................................3

附录A（资料性）油菜MNP标记和标记检测引物...........................................5

I

DB42/T2215—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中国农业科学院油料作物研究所提出。

本文件由湖北省农业农村厅归口。

本文件起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、江汉大学。

本文件起草人：刘佳、胡琼、彭海、李甜甜、梅德圣、汪文祥、成洪涛、李超、王会。

本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-87665821，邮箱：

hbsnab@126.com，有关修改意见建议请反馈至中国农业科学院油料作物研究所，联系电话：13720301092，

邮箱：liujia02@。

III

DB42/T2215—2024

甘蓝型油菜品种真实性及其实质性派生品种MNP鉴定法

1范围

本文件规定了油菜品种鉴定多核苷酸多态性（multiplenucleotidepolymorphism,MNP）标记法

的原理、试剂或材料、仪器设备、测定步骤、结果分析方法及评价标准。

本文件适用于甘蓝型油菜（BrassicanapusL.）的品种真实性鉴定和实质性派生品种鉴定。其他芸

薹属（Brassica）植物品种（系）可参照使用。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

GB/T38551植物品种鉴定MNP标记法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

多核苷酸多态性multiplenucleotidepolymorphism(MNP)

在基因组水平上由多个核苷酸引起的序列多态性。

实质性派生品种essentialderivedvariety(EDV)

由原始品种派生或者由原始品种的实质性派生品种再次派生，且保留了原始品种的基本性状；与原

始品种存在明显区别；受原始品种的基因型或基因型组合控制的基本性状的表达与原始品种相同。

平均覆盖倍数averagecoverage

在基因组上比对到所有标记位点上的所有测序片段的总数与标记位点总数的比值。

检出的标记位点detectedmarkers

至少有一个等位基因型且有20条及以上测序片段支持的标记位点。

4原理

利用多重聚合酶链式反应扩增(PCR)和二代高通量测序，获得样品基因组上的MNP标记位点的多态

性，判定标记位点的分型结果并依此作出鉴定结论。

1

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5试剂或材料

水：GB/T6682一级。

DNA提取试剂盒。

多重PCR扩增与文库构建试剂盒。

高通量测序试剂盒。

MNP标记引物：见附录A。

6主要仪器设备

PCR仪。

高通量测序仪。

核酸定量仪。

移液器。

7测定步骤

操作要求

样品准备、DNA提取、多重PCR扩增与文库构建、高通量测序各自在规定的实验室按单一方向进行操

作，且保持实验室通风良好，严防气溶胶污染。不同区域的仪器设备应专用。

取样方法

7.2.1从植物品种群体中的抽样应具代表性，抽取至少20个个体样本混合物。农作物种子扦样应符合

GB/T3543.2要求。

7.2.2样品中个体的类型宜为新鲜且幼嫩的叶、根、茎、胚等器官或组织。

DNA提取

样品提取与纯化的DNA溶液应在260nm与230nm处的吸光度比值大于2.0；在260nm与280nm处的吸光

度比值介于1.7～1.9；DNA电泳主带明显，无明显降解拖带和RNA残留。

多重PCR扩增与文库构建

按多重PCR扩增与文库构建试剂盒的说明书进行DNA质控、多重PCR扩增、文库构建与纯化。且规定

多重PCR的扩增循环数不高于20个。

高通量测序

按高通量测序试剂盒和高通量测序仪的操作说明进行高通量测序。

高通量测序的平均覆盖倍数设置为700倍以上，测序拼接后完整长度大于标记引物在参考基因组上

的扩增长度。

测序数据质量控制

数据质量控制如下：

2

DB42/T2215—2024

a)利用MLMNP品种鉴定软件（软件著作权2019SR）将样品的测序数据比对到参考基因组的标记

位点上，统计第一次检测的标记位点的覆盖倍数C1；

b)当C1＜500时，判定样品的测序数据量不足，从7.3或之前的步骤开始重新实验至第二次检测

的标记位点的覆盖倍数C1≥500；

c)当C1≥500时，进一步计算检出的标记位点的比例R1。

R1按式（1）计算

T

R=1×100%………（1）

1T

式中：

R1——样品检出标记位点的比例；

T1——样品检出标记位点的数目；

T——样品检测标记位点的数目。

d)当R1≥95%时，判定测序数据合格；

e)当R1＜95%时，判定文库构建失败，从文库构建或DNA提取之前的步骤开始重新实验至第二次

检测的标记位点的平均覆盖倍数C2≥500；

f)当C2≥500时，进一步计算第一次和第二次检出的标记位点的比例R2。

R2按式（2）计算

2T12

R2=×100%…………………（2）

T1+T2

式中：

R2——第一次和第二次共同检出的标记位点的比例；

T12——第一次和第二次共同检出标记位点的数目；

T1——第一次检出标记位点的数目；

T2——第二次检出标记位点的数目。

g)当R2≥95%时，判定测序数据合格。

8结果分析与判定

结果计算

遗传相似度（GeneticSimilarity,GS）按式（1）计算：

n

𝐺𝑆=𝑖𝑗×100%··································································（3）

𝑁𝑖𝑗

式中：

𝐺𝑆——待测品种与对照品种的遗传相似度（%）；

𝑛ij——待测品种与对照品种中均检出的但基因型无差异的标记位点的数目；

𝑁ij——待测品种与对照品种中均检出的标记位点的数目。

结果判定

8.2.1品种真实性判定规则

3

DB42/T2215—2024

当待测品种与对照品种的遗传相似度（GS）小于92%时，判定为“不同品种”；

当待测品种与对照品种的遗传相似度（GS）大于或等于92%时，判定为“疑同品种”。

8.2.2实质性派生关系判定规则

当待测品种与对照品种的遗传相似度（GS）小于85%时，判定为“非实质性派生品种”；

当待测品种与对照品种的遗传相似度（GS）大于或等于85%时，判定为“疑似实质性派生品种”。

结果表述

待测品种与对照品种比较位点数为，差异位点数为，遗传相似度为，

判定为。

例1：待测品种A与对照品种B比较位点数为502，差异位点数为2，遗传相似度为99.60%，判定为疑

同品种，疑似实质性派生品种。

例2：待测品种A与对照品种B比较位点数为499，差异位点数为45，遗传相似度为90.98%，判定为不

同品种，疑似实质性派生品种。

例3：待测品种A与对照品种B比较位点数为487，差异位点数为152，遗传相似度为68.79%，判定为

不同品种，非实质性派生品种。

4

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附录A

（资料性）

油菜MNP标记和标记检测引物

表A.1给出了油菜MNP标记和引物序列。

表A.1油菜MNP标记和标记检测引物

序染色

正向引物反向引物

号体

1A01GGGTTTGCATGTTTAATAAGGATATGGAGAAACTGTGTGTGTATGGTTCGACT

2A01ACCAGCCAAACACAAAAGACTAATTTACTATATCAGAGGTTTTCTCCTCTCAATGGT

3A01TGTTGCCTCTAAGTTTCAACAATGTTGGGATATTCTCACATTAGCTACTCCTCACTA

4A01TCCAATTACCGATACAAGAGACTTTGTTTGCAAAGTCTCCCACACTGGAAATTATAAAT

AAATAAAATTCAGTTTCTAATGCGATTTCATC

5A01CCGGCTTCGTATGTTTGTATGCT

C

6A01TATCTAGGGAAGTTCTAACAGTGGCTTCTCAAGCGGGTAGCACCAAAAGAAG

7A01GATACGAAGTTTTCAAATCAGTTCACTTGTAAATAGAAGTGTAGTCAATTATTGTTGCGT

8A02ATAAAATGTGGAAAGCAAACCAAAATCCTTACTTAAATGGAGAGATTCGACGAAACTG

9A02AAGTACGTCTCCGATGAATGACATGCGTTTGATTGCCTTCAGTACTAGACTATAT

10A02GTGTCCTTCGGATATTTTTGCTGGGTCTTTCTGTAATCACATCGGACGATATT

11A02CGAAAACAAACCGAAATTCTAAATCCCAGGCTTTATTTTGGGAATATGTGGCA

12A02CAGTAAGCAAGATGGAGGAAAACAGCCTGAATGCTCTTGTCTGCTTCA

13A02TGAAAATCGGATGAAAAGCAGATTATTTCACCTACGTGAGATTCTCTCTTTCTTCTTTTA

AGTCACAATACATCAAATTCTCACTAACAT

14A02TAAATAAAATAATCACGCAGAACCGCG

C

15A02GGTGAAGCACATGTTGGAAGACACCCAAGTCATTTTCATGTGCAACAAA

TGAACCGAACTTGAAGCAAAATTTGTAAA

16A02ATGATCCAATGATTGATTGAGCTCAGT

T

17A02AGTGTTTCAATCATTATGAATGTGTCAGTTTACCACGGGAATTCAAAGAACTTAAACA

18A02ATTCCGACATTTGGAGAACCTATAGATAGACCCAAAACCTTTAGGGTGAACCATAAA

19A02GCGGAATAAATGTTGAAGAAGAGGTAAACTATGGCTGCTGTTCAAAGTGTTTATTTC

20A02CCAATCAAATCAAATCAAATCAGAGCCATGTCAGTATAAGAGAGCTGAGAAAGGTG

5

DB42/T2215—2024

表A.1油菜MNP标记和标记检测引物（续）

序染色

正向引物反向引物

号体

21A02CATTGGTACGTTAGTTTATAGCCTAAAGCTAATTTCATTGTCAGACTGTGTTAACGTTAC

22A03GTCGTGTAGATGTGACCGACTTATCACAGCATATAACTTCATGTATGCAGAT

23A03AAGCACAAAGACAACAATACCCTCTGCTTTAATTATTTTGACACGTGGCGAAT

24A03AGCTTCAAATGGAGTTTAGATCGGTCCGAATGAAGTCGAAGATAAGAATTTGAAG

25A03ACCGAACTTTTTGAAAAAGTTTGAATCTGGCAATTGTTCTAACAAACCAAAAGAGAG

26A03CGTATACCGTATCGGTCGGTTTTCATGTTGGTCGAGTTTCTTACCTG

27A03TTGAAAATGTCTCGGAGGATAAGAACAACCATTATAAAAGCATTGTCTGGTCTGAAT

28A03CATAAAAGAACGCTCCAACACGATCAGGAACGCTTCGTTTACTTTAACC

29A03TGCAATTTAATCCACGAATTCAAAATTCCAAATTTATGATGAGCAGCTCCAGTGAT

30A03TGATACATCTCCTCGCATAGTTAGGTAGCGGTAGTGAGAAAGAAAGTTCC

TTCGTTACAAACTATGACAGATGTTTTGTCGAACGTATAGCTAACATCATTTAGTGTCTTAC

31A03

TAA

32A03TAGACGATTTTACAAGCGACAATTATACGACTTGGAGATGATTCTGATTGTCAAGC

33A03GTGGAGACTCGAGAGAGAGGAATGATAGTTGGTGAACTTTTATGCACTACAA

34A03CGCAGTTGATATACTGGGTACCATATGCAAATGTTTACTTCTTTAAAAGGACGT

35A03GCTATCATTAGTAAAGAGTCTACGAACGTTTTAAGTACCTCAACTGTCCACTTAGCTA

36A03TGGCAATACGTAATTGATTTATTAACCGGACTTGTTCTCTTTGGCGTCGTTT

GAGACTTGAAAGCCTTTCTTTTTATTTTAATT

37A03TCACTCGTTTTCATATACAACTCATCATGT

G

38A03ACTCTATTTCTGTGGGAATTTTAGAGGAACTTGCGCAAAATTATTTTTGAACTAACTGT

TTTTTGTGAAAGGGTTTAAACAACTAGAATTT

39A03TTTTTGAATTATATTGGAGTATCCTGGCCT

C

AAAAATCCTTCCAGATGTTACATAAGTACT

40A03GGTTGGCTTCGCTCAAGGTAG

T

AAGAGATTCTTCAAATAGAAGTTCATGTAAC

41A03GGAAACCATGCGCGAACCTA

TT

42A03AGAGTCGACGGACCACTAAGTAAGAAGTGAACATTATTGGTCATTCATGGTA

43A03GGAAACTTTGGCACGTGCATATCCCTGAATCGCGTGATAGCTAATTAAA

44A03GCATGTGTAGGCAAAACACCTAGTTGGCACCCACTCTACTCTACCTAG

6

DB42/T2215—2024

表A.1油菜MNP标记和标记检测引物（续）

序染色

正向引物反向引物

号体

45A03GTAGAGTTGCAGTCCGTTAGCTACATTTATACCCGTGCTGGAAAATCA

46A03AGATCATATCAGCTAAATTTTGAGCCCATTTCCTAGTAAATGCATATGCATGTGAAGT

47A04AGCTTCGGTGGACTAACCACTAGGTAACCGAGCCATGGGATTTAA

48A04TCATTTTTCAGACTTGGCTAACCCTTGCGATCGCTTCCAGATATTGGTTAATT

TTACAACTTTATAACATGTATTCGTTAGGCCCATGTTTTGCAATACTATGTTTCTATTCAAGA

49A04

AC

50A04GACCTGAGATCTCTAGACAAACACTACTTTTAATCAGTGTGAATCTGGTTGAATGG

51A04CTTTATTTGGTGTTGATTAACCATTGGTGTTATGCTTTCCATTACTGCTGAAGCTT

ATGTGTTCTTTTTAGATGGTTTAATTTTCTCTCTTTTCCAAATCTGTAAATTTGACAATATAC

52A04

TCA

53A04GAGGATTATGGAATTGATTCGGATAGCATGGATATCATCGTCGTCTGTAGCA

54A04TTGTGATGACTTCTACGTGATTATGAATGTTGAGATGAAACAAGAATTCCATCCACAAT

55A04ACGCTCTTTAGTTGCAATTGAATACGATGCACCGTTCATAGTTCCTATGAAT

CCAAAAGCTCTAATAATAATGAATCATTCG

56A04GATCATGCATTTAGGCATTACTTCAATGA

GA

57A04GAGCTGTTGCAGAGAATAATAGAAGGACGGTGCCCAATTTGAATCAATCAATT

CAAAAGAGTCTTAGAGTGGTATAGAAAGAA

58A04TATTTGATCGAAAACGATCGATTTTCTGTTC

GG

59A04TGACAGATATTGGATTTCGTTGGCATTCACTACAATAAATATGCAATTCCCGACAA

60A04CATGATCTGAATTCCATAGATGCGAAACTGACTGTACAAGATGCCGATCTTC

61A04GAAACTAGGTGAATCTCAAGTGAATCCACGCTGTCTCTTCTGCTAGCTAC

AATCCACGAATGGATATTCTTTCTGATTATTAGTGTGATGCATGTAAAATCATTAATTATGC

62A04

CAAT

63A04GAAAATCTTGCATGACAACTTGTCAACGGCATATACTGACATCTGTTGATGATAACT

64A04GTATACAAGTACTTTACTAGGACCAATGCAGGAAAACAAGTTAAAAGTCAGAACCCAT

65A04TTTAATCCTTTAAGAACCCAAACCGTCTAACTAAGGCAAGACACAATTTATCAAGCT

66A04CACATGGTAAGTGGAAAGTGGTAAACTTCTAGTTTCTTGTTTTCAGTGAAGTTAGACA

67A04CATTTTGGTAGAATTGTTGAATCAAACAGTTGGTCAGTAACCTTATACTTGAACCTTACT

7

DB42/T2215—2024

表A.1油菜MNP标记和标记检测引物（续）

序染色

正向引物反向引物

号体

AGCAAAAGCCATGTAACCATTATATTTTATA

68A04ACGATAGCCCGTGTCAAAGAC

C

69A04ATTAACCCTCGAGAGACTCTTCTGTAAATCGTTTTGGTTATGAATGATTTGCCT

70A05AGTGATTGTTGTCTCAGCTAGAAATACTACGTCTGTGACTGGTGGTGTTGATT

71A05CAGAGGGAGTAATTACGAATGGCTCAGACAATGGAGGGAGACGTTA

72A05TACTGTGCGAGTGAAGCCAAAATCGACTCTGAACGTAGAGGAATTTTATTCTT

73A05ACATGGTGAAACATAAATTTGCAATCCTGCCTAAAGCAAAAATAAAAGATTGGCCTAT

74A05TCAAGAAAAATTATGATGGCGGTTGAAAAATTTTGCTCAAAATCCATAGAAAAGTTGGT

75A05ACAAGACAACGGTTCATTTCCCACCCGAGAATATCTGTTGGTTGGTTT

76A05TTGAAAGCAAAACCCTAAACAGGGAGGTTCCCACTGCAACTTCCATAA

77A05AAAAATATGTCAACTTTCAAGGCCTAAACACGAGTTTGGCGAGAGTTGTTTG

AGAATACCATAATATTTTAAATGGCCATCTAGTTTCATCATTCATTTCATCCAAACATTTCAA

78A05

CAC

79A05GGCTTTTAGCCCATAATATATTCCTTTCCTAGAAACTGCCGACATGTCTTCTT

ATTAATGTTAGCCCTATGAATAGTCGATCAA

80A05CTATTAACATAGACAAGTCTGGGATTGAGAC

AT

81A05CCTAGGCCCTTTCCATCTTTATAACCAATATGTTCACTACAAAATGACCACGATTT

82A05TTCTCCATGCGAAAGGGTTTCAGCGCGAATCTTAACCTAGTTTGATTTAAAA

83A05CTTTCGTCTTTGGTAGGGCTCTTTCAATATAATCATCTTCAACCATGTGTGCT

84A05ACCAATCGCAGGTGTAACAACTTGGAGAGAACAATATGTTTGCGAAGA

85A06ATGATTGTTTGGATAAACTCTCTTAACTGAACATGATCATCCATGTTTTATGCCCTTAAT

86A06CAGTGCCTATACAGTCTAACCCTTAACGTGAACCTTGATATCAAAACTTCTTTTGGT

87A06CAATTCAGACAACCGTTTTCAAAACATTTTGTCGATTTGTGTATGTGAATCCGT

88A06TCATTAATTTGCAGAAAGATGGATGAACTTGTTGTTGAAGTGCACCAAAATTTAAGTACT

89A06CTTCCGTCACTCGATCATCTTCTTAAGCGTCAGCATCGAACTTATCAG

TCATGGAGTTTTGCTGAAATAATATTTCAAA

90A06AGAATCATCGTATTATGTCCAACTTTTGTCA

AT

GGAGAGAAATAGAGTAAGAAAAGTTGAGTA

91A06AGAGTGGAGTTGGAGAAATTTTTACTCTA

CG

8

DB42/T2215—2024

表A.1油菜MNP标记和标记检测引物（续）

序染色

正向引物反向引物

号体

92A06AAGCTGACTTAGGATTTGTGAAAGATTCTTAATAGTTTGTGGTGCTTGCTCAATAT

93A06CCATTCAATTTTTGTTTGATTTGTTCCACAGGGATCATAGAGAGAGAGAGAGAGAGA

94A06TGAGCTAGGAAAAGACTAGTTGGGATTTCCAATCTCATTTGGTTTCTAGAGTACC

95A07AACAGCCATAACCACAAACAAAGATGGGTGATGATTGTTTCGCCTATTCCTATTTA

AGCCCAATTCAAATAAAACCTCATAATTTGACGATCATAGCTAAATGTCTAGAGATGTCTTC

96A07

TCTA

97A07TTCTTTTTCTTAGTTGCCAGAAAAGAATACACATCACGAAAATGTATCACCATAAGTTC

98A07AAGAAACCAACAAGCACTTCATGTATTTTTAAAATATCCACTACGGTTTTTAGCCGT

99A07GCGGGATACGTTTAAGTTCAGTTCACTCTAAGGAGGAAACTAACACATTAAGGT

TTACTAAGCAAGATGATGATATGAGTTTTTA

100A07AAAATCTCAACAAATATGAGAGAGTTTTCG

GT

101A07GCTTATAAAGCTTTTGGAATCACACCACCTCGCACGTTATGGGCTTATATC

102A07TTCGTTGTTTCCAGGCTGTACACATCAAATTTGGTGTGAGATATAACGAAGC

103A07GGGATGTTACATTAAAATTCAAAGTGATGTCACGCATGCGACTACTAAAAACAG

104A07CGACAGTGTGAGCTCCCATAACAAGAACCTTTTGAACCCACCAGAA

105A07CAAATGATTAGCAAGATGCGAGTCTTAACGAAAATGAGTGGACCATAAAACTGAAGG

106