DB36/T 1190-2019 灌木辣椒种质SSR分子标记鉴定技术规程

ICS65.020.01

B05

DB36

江西省地方标准

DB36/T1190—2019

灌木辣椒种质SSR分子标记鉴定技术规程

TechnicalregulationsforidentificationofcapsicumfrutescensgermplasmbySSR

molecularmarker

2019-12-27发布2020-06-01实施

江西省市场监督管理局发布

DB36/T1190—2019

目次

前言................................................................................II

1范围..............................................................................1

2规范性引用文件....................................................................1

3术语和定义........................................................................1

4原理..............................................................................1

5主要仪器设备与试剂耗材............................................................2

6试剂配制..........................................................................2

7核心引物..........................................................................2

8参照种质..........................................................................2

9操作步骤..........................................................................2

10指纹比对.........................................................................4

11结果判定.........................................................................4

附录A（资料性附录）主要仪器设备与试剂、耗材........................................5

附录B（规范性附录）试剂配制........................................................6

附录C（规范性附录）核心引物........................................................8

附录D（资料性附录）参照种质........................................................9

I

DB36/T1190—2019

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的的规则起草。

本标准由江西省农业农村厅提出并归口。

本标准起草单位：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所。

本标准主要起草人：周坤华、方荣、陈学军、袁欣捷、郭丽虹、罗海平、黄国东、袁青云、涂年生。

II

DB36/T1190—2019

灌木辣椒种质SSR分子标记鉴定技术规程

1范围

本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子标记法快速鉴定灌木辣椒

（CapsicumfrutescensL.）种质技术有关的术语和定义、原理、主要仪器设备与试剂耗材、试剂配制、

核心引物、参照种质、操作步骤、指纹比对、结果判定。

本标准适用于灌木辣椒（CapsicumfrutescensL.）种质的SSR分子指纹比对鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本使用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

待测种质germplasmtobetested

待鉴定的疑似灌木辣椒种质，由送检人提供。

3.2

指纹图谱fingerprint

采用SSR引物扩增出的DNA片段，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到不同大小的DNA片段图谱。

3.3

指纹比对fingerprintintercomparison

将待测种质与参照种质的SSR指纹图谱进行比对，分析待测种质与参照种质的SSR指纹是否有差

异，并确定其大小。

4原理

SSR分子标记，广泛分布于辣椒基因组中。不同种质间每个SSR位点重复单位的数量可能不同，因

而形成SSR标记多态性。由于每个SSR位点两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，因此，可根据其

两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA序列进行扩增。通过电泳分离得到

1

DB36/T1190—2019

大小不同的扩增产物片段，经硝酸银染色加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电

泳技术可以鉴定灌木辣椒种质。

5主要仪器设备与试剂耗材

主要仪器设备与试剂、耗材参见附录A。

6试剂配制

试剂配制方法参见附录B。

7核心引物

从120对SSR引物筛选出来，可以鉴定灌木辣椒种质的特异性SSR引物。相关信息参见附录C。

8参照种质

参照种质为用于与待测种质进行指纹比对的若干标准灌木辣椒种质和一年生辣椒种质（Capsicum

annuumL.），在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种。参照种质参见附录D。

9操作步骤

9.1样品准备

种子样品的扦样和保存，按照GB/T3543.2的规定执行。选取每个待测种质和参照种质的样株10株，

每株取新鲜、幼嫩、健康叶1片混合制样并做好标记，用纱布包好并置于液氮罐中。

9.2DNA提取

采用改良CTAB法或试剂盒法提取样品DNA，试剂盒法按试剂盒说明书进行提取。改良CTAB法DNA

提取步骤如下：

a）将混合样品放入研钵中用液氮磨成粉末，然后迅速将粉末勺入2mL离心管的2/5处，加入预热至

65℃的CTAB提取液1mL（加入前先加1%的β-巯基乙醇），充分混匀后将离心管放入65℃水浴锅中，水

浴60min，每隔5min摇荡一次，使之充分反应；

b）取出离心管静置数分钟后放入4℃高速低温离心机中，13000rpm离心15min。取上清液至另一离

心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）后，充分混匀，静置10min，13000rpm离心10min；

c）取上清液800μL置于新的1.5mL离心管中。加入2/3体积冷的异丙醇，轻晃，置于-20℃冰箱30min

或者过夜；

d）取出步骤c的离心管在4℃条件下，13000rpm离心10min，弃上清。用75%乙醇洗涤DNA两次，

自然晾干；

e）向1.5mL离心管中加入dd