WS/T 594-2018 蝇类抗药性检测方法 家蝇 不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法

ICS11.020

C05

WS

中华人民共和国卫生行业标准

WS/T594—2018

蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酰胆碱

酯酶等位基因检测法

Testmethodsofflyresistancetoinsecticides-Amolecularmethodfordetecting

insensitiveacealleleintheMuscadomestica

2018-03-01发布2018-08-01实施

中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布

WS/T594—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准主要起草单位：中国科学院动物研究所、北京市疾病预防控制中心、扬州大学、中国疾病预

防控制中心传染病预防控制所、中国农业大学、中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行

病研究所、上海市疾病预防控制中心。

本标准主要起草人：邱星辉、李梅、曾晓芃、钱坤、周小洁、李静、刘起勇、高希武、赵彤言、冷

培恩。

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WS/T594—2018

蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法

1范围

本标准规定了家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因的检测方法。

本标准适用于家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸位点基因型的检测。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

乙酰胆碱酯酶acetylcholinesterase

存在于生物体的一种水解酶，由乙酰胆碱酯酶基因ace编码。

2.2

等位基因allele

存在于同一物种的相同基因的不同形式互称为等位基因。

2.3

342G、342V和342A

342G、342V和342A分别表示家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸残基位点上的氨基酸为甘氨酸（Gly）、

缬氨酸（Val）和丙氨酸（Ala）。

3样本采集

采用诱捕或网捕等方法从现场采集家蝇成虫内，浸泡在100%乙醇溶液中带回实验室。浸泡样品可在

4℃条件下短期（6个月内）保存，可在-20℃以下长期保存。

4引物

引物F的序列为CGGTGCATTTGGGTTTCTAC，引物R的序列为CGTAACCGCTAAGATCTGCTG。引物设计参照附

录A。配制为10μmol/L浓度，保存于-20℃冰柜。

5仪器设备

5.1PCR（聚合酶链式反应）仪。

5.2琼脂糖凝胶电泳仪。

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WS/T594—2018

5.3凝胶成像仪。

5.4恒温水浴锅。

6主要试剂

6.1DNA聚合酶（Taq酶）。

6.2限制性内切酶Bsp1286I。

6.3限制性内切酶EaeI。

7操作步骤

7.1在PCR管中加入10×PCR缓冲液(含100mmol/LTris-HCl,500mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2)

2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2.0μL，引物F0.5μL，引物R0.5μL，单头家蝇的基因组DNA1μL

（100ng～300ng，提取方法可参见附录B，也可用商售的DNA提取试剂盒或其他类似方法提取）和Taq

酶(2～5个单位)，用灭菌水补齐至25μL，混匀。

7.2将PCR管放入PCR仪中，设置PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，50℃30s，72℃

30s，35个循环；72℃10min。运行程序。

7.3PCR运行结束后，取5μLPCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在160V，电泳

20min后在紫外光下检测，有清楚单一的609bp的条带的PCR产物用于进行以下酶切反应。

7.4取合格样品（即电泳检测产物为609bp）的PCR产物设置两个酶切反应，反应A用Bsp1286I酶、

反应B用EaeI酶进行酶切，酶切反应体系的设置根据酶产品的使用说明进行（参见附录C）。

7.5将酶切后的产物上样在1.5%的琼脂糖凝胶上，电压设定在160V，电泳20min后在紫外光下检

测。

8基