T/CI 160-2022 极端环境真菌的分离、培养、保藏和应用技术指南

ICS07.100.01

CCSB04

团体标准

T/CI160—2022

极端环境真菌的分离、培养、保藏和应用技

术指南

Technicalguidelinesforisolation,culture,preservationandapplicationofextreme

environmentalfungi

2022-12-15发布2022-12-15实施

中国国际科技促进会发布

T/CI160—2022

目次

前言.................................................................................II

引言................................................................................III

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4缩略语.............................................................................2

5试剂和材料.........................................................................2

6耗材与仪器.........................................................................3

7样品采集、现场处理及资料整理.......................................................3

8极端真菌的分离、培养、纯化.........................................................4

9极端真菌生长温度的确定（无菌操作）.................................................6

10嗜盐真菌抗盐性的确定（无菌操作）..................................................6

11极端真菌降解毒素、钝化重金属的指标及检测方法......................................6

12极端真菌全基因组DNA的提取........................................................7

13极端真菌18srDNA基因片段的扩增...................................................7

14极端真菌的分子鉴定................................................................7

15极端真菌样品及种质资源保藏........................................................8

附录A（资料性）极端环境真菌样品采集、鉴定、保藏记录表格式..........................10

附录B（资料性）极端环境真菌的分子鉴定..............................................12

参考文献.............................................................................13

I

T/CI160—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由中国国际科技促进会提出并归口。

本文件起草单位：沈阳农业大学、辽宁伊品九利农业科技发展有限公司、沈阳汉明种业有限公司、

东北农业大学、吉林大学、沈阳市食品药品检验所、沈阳九利肥业股份有限公司、黑龙江省农业科学院

耕作栽培研究所、香港中文大学。

本文件主要起草人：张世宏、魏毅、于术军、刘庆玉、李凤兰、李桂华、耿丽娟、李柱刚、林汉

明。

II

T/CI160—2022

引言

本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及3.1、3.4、5.4、5.12、5.17、5.18、

7.1、7.2.1、7.2.2a）、7.3、7.4、8.1、8.2.1、8.3、9.3、10、12、13、14、15中相应内容的专利《一

种抗盐耐碱的曲霉菌株、其ITS序列及应用ZL201810855005.0》、《一种源于极端抗盐碱曲霉的纤维

素酶基因及应用ZL201610005024.5》、《一株抗盐碱赭曲霉菌株W1及其菌剂和应用ZL201910659129.6》、

《耐碱嗜盐类型的灰绿曲霉菌株及其在环境治理中的应用ZL201310162347.1》的使用。

本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。

该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在公平、合理且无歧视的条款和条

件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。

表1中列出的专利权人持有本文件涉及的专利。

表1持有本文件涉及的专利的专利权人相关信息

专利持有人地址

史洋北京市朝阳区广渠路36号首城国际B区11号楼1单元2202

吉林大学吉林省长春市前进大街2699号

请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责

任。

III

T/CI160—2022

极端环境真菌的分离、培养、保藏和应用技术指南

1范围

本文件提供了极端环境真菌（以下简称“极端真菌”）的来源，分离、培养、鉴定、保藏方法和生

物技术应用指南。

本文件适用于极端真菌的分离、培养、鉴定、保藏与应用。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB2761-2017食品安全国家标准食品中真菌毒素限量

GB13078-2017饲料卫生标准

GB15618-2018土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）

GB36600-2018土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准（试行）

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

极端环境真菌extremeenvironmentalfungi

在常见普通真菌无法生存的极端环境条件下（如高温低温、高盐、高毒素、缺水、脱水、低氧厌氧、

高低压强等）能够正常生长、发育、繁殖的真菌。

注：常见的普通真菌一般生长在温度22℃～36℃，湿度95％～100％，pH5～6.5的有氧环境。普通真菌对高/低温度、

高渗透（高盐与脱水）、高毒素、低氧或厌氧、高低压强等敏感、适应性差。

嗜冷真菌psychrophilicfungi

最适生长温度小于等于15℃、最高生长温度小于等于25℃的真菌。

嗜热真菌thermophilicfungi

最适生长温度大于等于40℃、最低生长温度大于等于20℃的真菌。

嗜盐真菌halophilicfungi

在大于等于5%钠、钾等常规盐离子浓度环境生长最快的真菌。

毒素降解真菌toxin-degradingfungi

适宜于在毒素环境生存，具有将呕吐毒素（DON）、黄曲霉毒素（AFT）、玉米赤霉烯酮（ZEN）等

毒素降解为低毒或者无毒物质的真菌。

钝化重金属真菌passivateheavymetalfungi

适宜于在重金属污染环境生存，具有钝化重金属，使其缓慢氧化或化合，减少离子状态，从而缓解

作物吸收的真菌。

重金属heavemetal

密度大于4.5g/cm3的金属。

注：在环境污染方面，重金属主要是指汞（水银）、镉、铅、铬以及类金属砷等生物毒性显著的重元素。重金属非

常难以被生物降解，相反却能在食物链的生物放大作用下，成千百倍地富集，最后进入人体。重金属在人体内

1

T/CI160—2022

能和蛋白质及酶等发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器官中累积，造成慢性中毒。

2018年我国颁布的《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）GB15618-2018》和《土壤环境质量

建设用地土壤污染风险管控标准（试行）GB36600-2018》规定了土壤环境重金属污染上限指标，超过此指标

即存在影响人类健康的危害，需要及时的修复和风控。砷在第一类土地中不能超过120mg/kg,第二类土地中不

能超过140mg/kg。镉在第一类土地中不能超过47mg/kg，在第二类土地中不能超过172mg/kg。铬在第一类土

地中不能超过30mg/kg，在第二类土地中不能超过78mg/kg。铅在第一类土地中不能超过800mg/kg，在第二

类土地中不能超过2500mg/kg。汞在第一类土地中不能超过33mg/kg，在第二类土地中不能超过82mg/kg。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

AFT（AFB、AFG、AFM）：黄曲霉毒素（Aflatoxin）

bp：碱基对（basepair）

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(HexadecylTrimethylAmmoniumBromide)

DON：脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol），又称呕吐毒素（vomitoxin）

EDTA：乙二胺四乙酸(EdetateDisodium)

MIC：重金属最小抑制浓度（minimuminhibitoryconcentration）

PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)

PDA：马铃薯葡萄糖培养基（PotatoDextroseAgar）

PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline）

NaCl:氯化钠化学式(Sodiumchloride)

Str：硫酸链霉素（Streptomycinsulfate）

ZEN：玉米赤霉烯酮（Zearalenone）

18srDNA:真核生物染色体上编码核糖体RNA18S亚基的基因

5试剂和材料

除另有规定外，试剂为分析纯和蒸馏水。

DNA胶回收试剂盒、各种毒素ELISA检测试剂盒、毒素荧光定量快速检测试纸条。

2xTaqPCRStarMix：pcr预混液。

极端真菌鉴定引物对ITS1和ITS4。

50×TAE电泳缓冲液：称取242.0gTris-base、37.2gEDTA-Na2·2H2O、57.1mL冰醋酸，溶解于

适量蒸馏水中，用10MNaOH溶液调节pH=8.3，补充水分定容至1000mL，室温保存。使用时需将50×

TAE稀释为1×TAE。

30%无菌甘油：水：甘油=7:3，121℃灭菌15min。

CTAB溶液：称取20gCTAB、29.2gEDTA-Na2·2H2O、1MTris-HCl100mL(pH=8.0)、5MNaCl280mL，

溶解于适量蒸馏水中，补充水分定容至1000mL，1%的β-巯基乙醇（现用现配），室温保存。

氯仿异戊醇混合液：氯仿：异戊醇体积比为24:1，在通风橱中，将异戊醇加入到氯仿中混合均匀

即可。

10MNaOH溶液：称取400gNaOH，溶解于适量蒸馏水中，补充水分定容至1000mL，配制成10M的

NaOH溶液。

PBS磷酸盐缓冲液：称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，溶解于适量蒸馏

水中。用盐酸调节pH=7.4，补充水分定容到1000mL，用0.22um的微孔滤膜抽滤灭菌。4℃保存。

琼脂糖凝胶：称取10g琼脂糖，缓慢加入1×TAE缓冲液，加热使之充分溶解，配制成10g/L的

琼脂糖凝胶。

PDA培养基，按以下步骤制备：

a)称取200g去皮马铃薯，切成小块，加适量水煮沸20min~30min（能被玻璃棒戳破即可），用

八层纱布过滤；

b)在过滤液加入18g琼脂粉，继续加热搅拌混匀，待琼脂粉溶解完后，加入20g葡萄糖，搅拌

均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装玻璃试管或者锥形瓶，用封口膜封口，121℃灭菌

15min。液体培养基PDB不加琼脂粉；

2

T/CI160—2022

c)PDA斜面培养基：分装量为玻璃试管高度的1/4（4mL~5mL），灭菌后趁热摆放斜面，制成斜

面培养基，倾斜度为试管中的培养基约占试管长度的1/2。

降解DON筛选培养基：称取1g（NH4）2SO4、3gKH2PO4、6gK2HPO4、0.5gNaCl、0.5gMgSO4·7H2O、

0.05gCaCl2、0.001gFeSO4·7H2O、0.05g蛋白胨、20g琼脂粉，溶解于适量蒸馏水中，用盐酸调节

pH=6.0~7.0，补充水分定容至1000mL，121℃灭菌15min。灭菌后，待冷却至50℃~60℃时，在无菌操

作台里加入抽滤除菌的氧化苯乙烯，终浓度为15mmol/L，趁热倒入培养皿,待培养基凝固即制成脱氧

雪腐镰刀菌烯醇筛选培养基平板，置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。

注：氧化苯乙烯是脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）类似物，可替代DON进行初步筛选高效降解DON毒素真菌。

降解AFT筛选培养基：称取5.0g（NH4）2SO4、2.5gKH2PO4、1.0gMgSO4、0.5gNa2HPO4·12H2O、

0.1gCaCl2、20g琼脂粉，溶解于适量蒸馏水中，用盐酸调节pH=6.5，补充水分定容至1000mL，121℃

灭菌15min。灭菌后，待冷却至50℃~60℃时，在无菌操作台里加入抽滤除菌的香豆素溶液，终浓度为

1g/L，趁热倒入培养皿,待培养基凝固即制成黄曲霉毒素筛选培养基平板，置于无菌操作台备用。液体

培养基不加琼脂粉。

注：香豆素是黄曲霉毒素（AFT）类似物，可替代AFT进行初步筛选高效降解AFT毒素真菌。

降解ZEN筛选培养基：称取2.0g(NH4)2SO4、0.5gNaH2PO4、0.5gK2HPO4、0.2gMgSO4、0.1gCaCl2、

20g琼脂粉，溶解于适量蒸馏水中，用盐酸调节pH=7.0，补充水分定容至1000mL，121℃灭菌15min。

灭菌后，待冷却至50℃~60℃时，在无菌操作台里加入抽滤除菌的赤霉烯酮溶液，终浓度为1g/L，趁热

倒入培养皿,待培养基凝固即制成玉米赤霉烯酮毒素筛选培养基平板，置于无菌操作台备用。液体培养

基不加琼脂粉。

含有重金属的PDA培养基制备：PDA培养基配方同5.12，调节pH=5.0(防止重金属沉淀),121℃

灭菌15min。灭菌后，待冷却至50℃~60℃时，在无菌操作台里加入过滤除菌的重金属溶液，趁热倒入

培养皿,待培养基凝固即制成重金属PDA培养基，置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。

含有NaCl的PDA培养基：PDA培养基配方同5.12，pH值自然，加入NaCl制成不同质量分数（%）

的NaClPDA培养基。