GB/T 14643.6-1993 工业循环冷却水中铁细菌的测定 MPN法

中华人民共和国国家标准

工业循环冷却水中铁细菌的测定MPN法GB/'r14643.6-93

Industrialcirculatingcoolingwater-Examinationofironbacteria

-MPNtest

1主题内容与适用范围

本标准规定了工业循环冷却水中铁细菌的测定方法。

本标准适用于工业循环冷却水中铁细菌的测定，也适用于原水、生活用水及粘泥中的铁细菌的测

定。

2引用标准

GB603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备

GB6682分析实验室用水规格和试验方法

3方法提要

本法采用多试管发酵技术，在29士1℃培养14d,如果试管内棕色消失而且形成褐色或黑色沉淀，表

明阳性反应，采用MPN技术，对被测试样中的铁细菌进行计数。

4试剂和材料

本试验方法中，除特殊规定外，应使用分析纯试剂和符合GB6682中三级水规格的水。

4.1硫酸镁(GB671)。

4.2硫酸钱(GB1396);

4.3磷酸氢二钾(HG3-1228);

礴.4氯化钙;

4.5硝酸钠(GB636);

4.6柠檬酸铁按;

4-7氯化钠(GB1266);

4.8氢氧化钠(GB629)溶液:46g/1-;

4.9盐酸(GB622)溶液-1+11;

4.10硫代硫酸钠(GB637);

4-11乙醇(GB678)溶液:75%(v/v);

4.12牛皮纸;

4.13医学脱脂棉。

仪器和设备

无菌箱(室)或超净工作台;

:;

蒸汽压力灭菌器;

国家技术监督局1993一08一06批准1994一07一01实施

GB/T14643.6一93

5.3生化培养箱;

5.4电热干燥箱:温度可控制在((60-280)120C;

5.5刻度吸管;1mL;

5.6刻度吸管:5mL;

5了试管:150mmX15mm;

5.8试管架;

5.9磨口三角瓶:100mL;

5.10磨口试M瓶,1OOOML;

5.11容量瓶;1OOOmL,

6试验前准备

6.，培养基的制备

称取下列试剂:

硫酸镁。.5g;

硫酸钱0.5g;

硫酸氢二钾。.5g;

氯化钙0.29;

硝酸钠。.5g;

柠檬酸铁按10.0g,

将上述试剂溶解在1OOOML水中，用氢氧化钠溶液(4.8)或盐酸溶液(4.9)调节pH至6.8士。2,

并分装在试管中，每管5mL,塞上棉塞，数支一捆，每捆管口用牛皮纸包扎，用蒸汽压力灭菌器121士10C

灭菌15-in,

6，2无菌稀释水的制备

6.2.1生理盐水的配制:称取8.50g氯化钠溶解在1OOOmL水中，混匀。

6.2.2将生理盐水(6.2.1)分装在100mL磨口三角瓶中，每瓶45mL。每个三角瓶塞子和瓶口间插入

一小纸片，塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口用牛皮纸包扎以防污染，用燕汽压力灭菌器121士1℃灭菌15min,

63刻度吸管的灭菌

6.3.1将洗净并烘干后的刻度吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10^-15mm，棉花不

宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。

6.3.2每支刻度吸管用一条约40-50mrn宽的牛皮纸条，以45，左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端

在头部，粗端用多余的纸条折叠打结，不使散开，标上量度，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于16。士

2C灭菌2h,

6.4采样瓶的灭菌

将洗净并洪干后的1OOOmL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸裹好，扎紧，置电热千燥箱中，于160

士2C灭菌2ha

65硫代硫酸钠灭菌

将硫代硫酸钠放入无菌箱(室)内，并均匀地摊在离紫外线灯30cm处，灭菌30min,

7测定步骤

了1水样的采集

7}1.1用无菌采样瓶采集被测样品，在采样过程中，要保护瓶口和颈部，防止这些部分受杂菌污染，瓶

内要留下足够的空间，以备测定之前摇匀。

7.1.2若采集的水中有余熟，应在采样前，在无菌操作下，于无菌采样瓶(6-4)中加人灭过菌的硫代硫

SBIT14643.6一93

酸钠(6-5)，加入的量为每升水样约。.1g,

7.1.3水样采集后立即进行测定，如果在2h内不能进行测定，应把水样放在冰箱中，4^-10℃保存，存

放时间不宜超过24h经冷冻保存后的水样需测定时，从冰箱中取出，30"C左右活化4-5h，再进行测定

了.2无菌箱(室)灭菌

把试验所用的无菌培养基、无菌稀释水、无菌吸管等用品放人无菌箱(室)内，打开紫外线灯灭菌

30min.

7.3水样的稀释和接种

73飞水样放人灭过菌的无菌箱(室)(7幻中，立即用75%(vlv)乙醉溶液的医用脱脂棉球擦手，点

燃无菌箱(室)内的酒精灯。

7.3.2-7.3.6的操作应在无菌箱(室)内的火焰区进行。

7.3.2选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种培养后无铁细菌生长，在空白稀释水样瓶((6.2)上

标上稀释度数。

7.3.3用10倍稀释法稀释水样，即用5mL无菌吸管(6.3)吸取5mL水样注人到45mL空白稀释水中

充分摇匀，此时稀释度为10-',

7.3.4另取一支5rtLL无菌吸管吸取5mL稀释度为lo-，水样注人到第二个稀释水中，充分摇匀，此时

稀释度为10-1，依次类推，直至需要的稀释度为止.

了.3-5将水样(包括稀释水样)分别接种于装有培养基的试管中(6.D，试管置试管架上，每个稀释度重

复接种5管(根据需要也可重复接种3管或4管)，每管接种1mL，每接一个稀释度更换一支无菌吸管。

了3-6另取一组试管培养基(6.1)不接水样，作为空白。

了4培养

在生化培养箱中29f1"C培养14d,

8计数与报告

8门凡产生褐色或黑色沉淀且原培养基中棕色消失变为透明状者，表明有铁细菌存在，以“+”(阳性)

表示，其余试管以“一”(阴性)表示。

8.2如果空白出现阳性反应，表明测定过程中有污染，本次测定无效。

8.3算出10进位稀释管中阳性试管数，以阳性组合指数记录下来。

8.4在10进位稀释中多于三个稀释度时，阳性组合的指数只需要用其中依次的三个稀释度，对这三个

稀释度的决定是先选出5管全部阳性反应的最大稀释度，然后选出其次相连的两个更高的稀释度，算出

阳性组合指数(见表例1,2,4)0

8.5若依照8.4所规定的原则选出三个稀释度后，有更高的稀释仍然产生一个阳性试管，就应该将这

一个阳性试管并入所选择的最高稀释的阳性结果中(见表I例3),

8.6根据阳性组合的指数，查表(附录A