GB/T 19180-2020 牛海绵状脑病诊断技术

ICS11.220

B41GB

中华人民共和国国家标准

GB/T19180-2020

-

代替GB/T191802003

牛海绵状脑病诊断技术

Diagnostictechniquesforbovinespongiformencephalopathy

2020-12-14发2020-12-14实

布施

国家市场监督管理总局申+

国家标准化管理委员会也叩

Gß/T19180-2020

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准代替GB/T19180-2003((牛海绵状脑病诊断技术》。本标准与GB/T19180-2003相比，除

编辑性修改外，主要技术变化如下

增补了H.E组织病理染色法、免疫组织化学方法和免疫印迹方法的适用范围，删除了"也可

用于其他动物的传染性海绵状脑病的诊断"(见第1章);

优化了临床症状的描述(见4.3);

优化了H.E组织病理染色法操作步骤(见5.1)和免疫组织化学方法操作步骤(见5.白，

增补了免疫印迹方法(见5.刀。

本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(S;\C/TC181)归口。

本标准起草单位:中国动物卫生与流行病学中心。

本标准主要起草人:王志亮、刘雨田、孙成友、迟田英、宋芳芳、邹艳丽、子小静、吴晓东、王树双。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为

GB/T19180-2003.

Gß/T19180-2020

51

ovineSpo鸣iformncephalopathy，BSE)是由阮病毒引起的牛的一种慢性致死性

牛海绵状脑病(BE

神经性疾病，对动物和人构成较大危害。世界动物卫生组织(OIE)将其列为严重影响国际贸易的动物

疫病之一，我国将其归为一类动物疫病。我国现行《牛海绵状脑病诊断技术))(GB/T19180-2003)系

2003年6月4日由原国家质量监督检验检疫总局发布，2003年12月1日起实施。该标准仅包括临床

症状、组织病理学、免疫组织化学等三种诊断方法，未包括OIE陆生动物手册指定的另一种确诊方法即

免疫印迹。免疫印迹方法比免疫组织化学方法更灵敏，特异性更好。因此，免疫印迹方法是牛海绵状脑

病诊断技术中一种更好的确诊方法，它能更好地服务子我国疯牛病的监测工作。

BSE分为典型BSE和非典型BSE。典型BSE是由子牛采食污染牛羊阮病毒的肉骨粉或者饲料而

引起，非典型BSE为自然发生的一种散发性BSE。自然条件下，BSE经由消化道传播，未发现水平和垂

直传播的证据。典型BSE的潜伏期一般为2年�8年，平均为4年�5年，多发子4�6岁的牛，2岁以

下罕见，6岁以上明显减少。根据病原的分子量大小，非典型BSE又分为H型和L型。非典型BSE的

平均发病年龄为11岁。BSE病程多为数月至一年，最终死亡。

大多数BSE病牛无典型临床症状，因此BSE的诊断应通过实验室检测来实现。BSE的病原是动

物机体内阮蛋白的异构体，在病牛血清里检测不iUBSE阮病毒抗体，所以血清学检测方法对子BSE来

说是无意义的。目前，实验室诊断方法多以检测BSE病原为目的，包括免疫组织化学方法、免疫印迹方

法、ELIS;\方法等，其中免疫组织化学方法和免疫印迹方法是OIE手册规定的BSE确诊方法。BSE病

牛的中枢神经被阮病毒侵害会出现海绵状空泡变性，在中枢神经保存良好且未发生自溶的情况下，应用

H.E组织病理染色法可以观察到这些病变情况。OIE手册规定H.E组织病理染色法是确诊BSE

的辅助方法，在使用免疫组织化学方法诊断BSE时应同时使用H.E组织病理染色法予以辅助确诊，

在使用免疫印迹方法诊断BSE时，如果样品适合进行H.E组织病理染色，那么也应同时使用H.E

组织病理染色法予以辅助确诊。

U

Gß/T19180-2020

牛海绵状脑病诊断技术

1范围

本标准规定了BSE诊断的临床诊断、实验室诊断及综合判定技术要求。

本标准适用子BSE的诊断，其中临床诊断适用子BSE的监测和流行病学调查，H.E组织病理染

色法适用子BSE中枢神经系统的病理诊断，免疫组织化学方法和免疫印迹方法适用子BSE的病原学

诊断。

2缩略语

下列缩略i吾适用子本文件。

BSE，牛海绵状脑病(BovineSpo吨iformncepha1opathy)

E

H.E苏

木精伊红(Hematoxylina叫eosin)

HRP辣根过氧化物酶(Horseradishp町oxidase)

PBS，磷酸盐缓冲溶液(Phosphatebuffereds01utio时

PK酶蛋白酶K(ProteinaseK)

PVDF，聚俯氟乙烯(Po1yvinylideneIluoride)

SDS，十二烧基硫酸销(Sodiumdodecy1s吐fate)

TBST等渗缓冲盐熔液(Tris-HC1bufferedso1utionwithTween)

3临床诊断

3.1易感动物

牛科和j苗科动物，包括各种牛、各种羊和各种猫科动物。

3.2临床症状

3.2.1行为异常

表现为不安、恐惧、异常震惊或沉郁，不自主运动，如磨牙、震颤，不愿经过有缝隙的地面或进入畜

栏等。

3.2.2感觉或反应过敏

表现为视、昕、触三觉过子敏感。对光线的明暗变化、外部声响以及颈部触摸过度敏感，这是BSE

病牛的特征性临床表现。

3.2.3运动异常

病牛步态呈"鹅步"状，共济失调，囚肢伸展过度，有时倒地，难以站立。

3.2.4体重和体况下降

病牛的体重和体况下降，表现出异常消瘦，体质虚弱。

1

Gß/T19180-2020

3.3病理变化

剖检无明显病变。

3.4结果判定

易感动物出现上述临床症状，又不能确定为其他疾病时，可判定为疑似BSE。

确诊应采集易感动物的脑组织进行实验室诊断。

4实验室诊断

4.111.E组织病理染色法

4.1.1实验室生物安全要求

实验操作应在生物安全11级以上的实验室进行。涉及有毒挥发性试剂的操作应在通风橱中进行，

如甲腔、甲酸、二甲苯、氯仿等。

4.1.2仪器设备

显微镜、切片机、电锯/钢锯、骨钳、眼科剪、直形慑(长约25cm)、子术刀、切片刀、烘烤箱、脱水筐、

染色缸、包埋模具、载玻片、盖玻片、玻璃棒、染色架、量筒(量程分别为100mL、1000mL、5000mL)、

通风橱。

4.1.3试剂

4.1.3.1蒸储水。

4.1.3.210中性福尔马林固定液(见附录八中1'.1)。

4.1.3.3无水乙醇。

4.1.3.4二甲苯。

4.1.3.5氯仿。

4.1.3.6软蜡(熔点56"C)。

4.1.3.7硬蜡(熔点60"C)。

4.1.3.8E染液，见八.2)。

苏木素染液(H.

4.1.3.91%盐酸酒精(见八.3)。

4.1.3.10饱和碳酸徨水肖子液(见八.叭。

4.1.3.1195酒精伊红溶液(见八.5)。

4.1.3.12中性树胶。

4.1.3.13无机试剂原料均为分析纯。

4.1.4采样

将牛头固定，用电锯从前额两牛角根部向枕骨大孔背侧缘方向锯开，使脑部暴露。剪开脑膜并切断

所有与脑部相连的神经和血管，取出整脑，包括大脑、小脑和完整脑干。大规模监测采祥时，可用专用采

祥勺(国家牛海绵状脑病参考实验室提供)从枕骨大孔处取出延脑部组织即可。采祥勺取祥时，先上下

左右囚个方向剪开脑硬膜，再用戴一次性乳胶手套的手指绕延脑转一转以切断脑神经和血管，然后紧贴

颅腔壁插入采祥勺，插入深度约5cm�7cm。用力将采祥勺的子柄往上翘，再往下切断脑组织，然后左

右切断脑组织，最后将切下的脑组织往外抠出。

2

Gß/T19180-2020

4.1.5固定

将所有组织直接放入10倍体积的10中性福尔马林固定液中渗透固定96h，换新配制的固定液

再固定48h.

4.1.6组织切片制作

4.1.6.1取材

把大脑、小脑、脑干组织分离开，分别横切成3mm�5mm厚的组织块，选取以下部位组织做进一

步处理，包括大脑、小脑、脑桥、丘脑、囚叠体、脑问、延髓。适当修剪这七块用于检测的组织边角以适用

脱水筐大小，剩余组织继续固定以备用。用脱水筐装好检测用的组织块，并用铅笔做好标记，盖好脱水

筐盖。投入新配制的10倍体积的固定液再固定72h。

4.1.6.2甲酸处理

将装有组织块的脱水筐移入98%甲酸中作用1h，自来水冲洗20min，然后再移入新配制固定液中

处理3h。

4.1.6.3脱甲醒

将装有组织块的脱水筐放入染色缸中，用缓慢流动的自来水漂洗24h。

4.1.6.4ij!l.7l<

将装有组织块的脱水筐放入染色缸中，依次在以下梯度酒精中分别脱水:

a)75%酒精浸泡2h。

b)85%酒精浸泡2h。

c)95酒精l浸泡2h.

d)95酒精11浸泡2h.

e)100%酒精1浸泡2h。

f)100%酒精11浸泡2h.

4.1.6.5透明

4.1.6.5.1氯仿1浸泡2.5h或者二甲苯1浸泡40mino

4.1.6.5.2氯仿11浸泡3h或者二甲苯11浸泡30min。

4.1.6.6浸蜡

依次在以下石蜡中浸蜡，温度为60"C

a)软蜡l浸泡40mino

b)软蜡11浸泡1h。

c)硬蜡浸泡1h。

4.1.6.7包埋

4.1.6.7.1若包埋模具为金属条结构的，则先组装好包埋模具，放置在光滑平整的金属台面上，再将熔

化的新硬蜡倒入包埋模具里，直至倒满，然后将浸好蜡的组织块放入其中(待切片的一面朝下，并放平

整)。如果一个模具里可以放置多个组织，则两个组织之间距离应大子1.5cm。冷却过夜，用切片刀修