DB61/T 1138-2018 水质 粪大肠菌群的测定 酶底物法

ICS13.060.70

Z16

DB61

陕西省地方标准

DB61/T1138—2018

水质粪大肠菌群的测定酶底物法

WaterqualityDeterminationoffecalcoliformsEnzymesubstratemethod

2018-04-12发布2018-05-12实施

陕西省质量技术监督局发布

DB61/T1138—2018

目  次

前  言...............................................................................................................................................................II

1范围...................................................................................................................................................................1

2规范性引用文件...............................................................................................................................................1

3术语和定义.......................................................................................................................................................1

4方法原理...........................................................................................................................................................1

5试剂与材料.......................................................................................................................................................1

6仪器与设备.......................................................................................................................................................2

7样品...................................................................................................................................................................2

8分析步骤...........................................................................................................................................................3

9结果计算与表示...............................................................................................................................................4

10质量保证和质量控制.....................................................................................................................................5

11废物处理.........................................................................................................................................................5

附录A（资料性附录）酶底物法培养基的基本成分.................................................................................6

附录B（规范性附录）粪大肠菌群检数表..................................................................................................7

附录C（规范性附录）51孔定量孔板MPN表.............................................................................................8

附录D（规范性附录）97孔定量孔板MPN表.............................................................................................1

I

DB61/T1138—2018

前  言

本标准按照GB/T1.1—2009和HJ168—2010给出的规则起草。

本标准由陕西省环境监测中心站和陕西省环境保护厅提出。

本标准由陕西省环境保护厅归口。

本标准起草单位：陕西省环境监测中心站。

本标准主要起草人：许锋、张会强、刘敏、周弛、吴卫东、马文鹏、张秦铭、宁西翠、许伊蕾、张

静雪。

本标准由陕西省环境监测中心站负责解释。

本标准首次发布。

联系信息如下：

单位：陕西省环境监测中心站

电话：029-85429127

地址：陕西省西安市雁塔区西影路106号

邮编：710054

II

DB61/T1138—2018

水质粪大肠菌群的测定酶底物法

1范围

本标准规定了水中粪大肠菌群测定的酶底物法的术语和定义、方法原理、试剂与材料、仪器与设

备、样品、分析步骤、结果计算与表示、质量保证和质量控制、废物处理的要求。

本标准适用于地表水、生活污水和废水中粪大肠菌群的测定。

当接种量为300mL时，方法的检出限为3MPN/L，检测范围为3MPN/L～230MPN/L；当接种量为100mL

时，方法的检出限为10MPN/L，采用51孔定量孔板的检测范围为10MPN/L～2005MPN/L，采用97孔定量孔

板的检测范围为10MPN/L～24196MPN/L。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本

文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T5750.12生活饮用水标准检验方法微生物指标

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

粪大肠菌群fecalcoliforms

粪大肠菌群，又称耐热大肠菌群（thermotolerantcoliforms）。是一种通常在44.5℃下培养发

酵乳糖产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

3.2

最可能数mostprobablenumber；MPN

基于泊松分布的一种间接计数方法。

4方法原理

粪大肠菌群在邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）培养基上培养产生β-D-半乳糖苷酶（β

-D-galactosidase），该酶可以分解色源底物释放出黄色的邻硝基苯酚，通过颜色变化定性，MPN法定

量。

5试剂与材料

1

DB61/T1138—2018

5.1除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682中规定的一级水。

5.2培养基选择市售商品化酶底物法试剂，或自行配制培养基，基本成分参照附录A。

5.3硫代硫酸钠（Na2S2O3）。

5.4乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）。

5.5氯化钠（NaCl）。

5.6硫代硫酸钠溶液：ρ（Na2S2O3）＝0.10g/mL。

注：称取硫代硫酸钠（5.2）10g，适量水溶解，定容至100mL，临用现配。

5.7乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：ρ（C10H14N2O8Na2·2H2O）＝0.15g/mL。

注：称取乙二胺四乙酸二钠（5.3）15g，适量水溶解，定容至100mL，摇匀，常温下可存放30d。

5.8灭菌生理盐水:ρ（NaCl）=0.9%（m/v）。

注：称取氯化钠（5.4）0.9g，适量水溶解，定容至100mL，经121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

6仪器与设备

6.1采样瓶：500mL棕色磨口玻璃瓶。

6.2恒温培养箱：44.5℃±0.5℃。

6.3高压蒸汽灭菌器：121℃、0.101Mpa。

6.4冰箱：0℃～4℃。

6.5恒温干燥箱：0℃～300℃。

6.6程控定量封口机：带51孔和97孔胶托。

6.751孔和97孔定量孔板：无菌。

6.8100mL无菌取样瓶。

6.9试管：Φ15mm×150mm，带透气胶塞。

6.10标准阳性比色盘。

6.11移液管：1mL、10mL，也可采用体积可调式移液器。

6.12锥形瓶：500mL。

6.13量筒：100mL。

6.14移液管、试管、量筒、采样瓶等均需包扎后经121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

7样品

7.1样品采集

7.1.1与其他项目一同采样时，先单独采集微生物样品。采样瓶（6.1）不得用水样洗涤，按照无菌

操作的要求采集水样于灭菌的采样瓶中。

7.1.2采集江、河、湖、库等地表水时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，距水面约10cm～

15cm处，瓶口朝水流方向，拔玻璃瓶塞，使水样灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果

没有水流，可握住瓶子水平前推。采样后瓶内要留足够的空间，一般采样量为采样瓶容量的80%左右。

采好水样后，迅速盖好瓶盖并扎上无菌包装纸。

7.1.3从龙头装置采集样品时，要选用完好无损的龙头，采水前将龙头打开至最大，放水3min～5min；

然后将龙头关闭，用火焰灼烧约3min灭菌，开足龙头，再放水1min。采样时控制水流速度。

7.1.4采集地表水、废水样品及一定深度的水样时，可使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样

点进行分层采样时，应自上而下进行。

2

DB61/T1138—2018

7.2样品保存

样品在10℃以下冷藏运输，运输时间不超过6h。实验室接样后不能立即展开检测的，应将样品放

入0℃～4℃冰箱（6.4）保存，在2h内检测。

7.3干扰和消除

酸性样品，应在分析前按无菌操作要求调节样品pH值至7.0～8.0。在采样瓶灭菌前加入0.4mL硫代

硫酸钠溶液（5.5）以除去余氯对细菌的抑制作用；在采样瓶灭菌前加入1.2mL乙二胺四乙酸二钠

（EDTA-Na2）溶液（5.6）以除去重金属对细菌的抑制作用。

8分析步骤

8.1水样接种量

水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样的接种量，水样的接种量可参考表1。

表1水样接种量参考表

接种量（mL）

水样类型

30010010110-110-210-310-410-510-6

地表水（湖、库）▲▲

地表水（江、河）▲▲▲

生活污水▲▲

废水（工业废水）▲▲

废水[医疗机构排放污水（处理前）]▲▲

废水[医疗机构排放污水（处理后）]▲▲▲

废水(畜禽养殖业等排放废水)▲▲

注：接种量为10-1～10-6mL时，需要稀释或逐级稀释，稀释方法见8.2.2。

8.2接种

8.2.1清洁水样

8.2.1.1接种量为300mL时，接种水样为2份100mL和10份10mL。

8.2.1.2量取2份100mL水样，分别加入2个100mL无菌取样瓶（6.8）中，各加入2.7g±0.5g酶底

物法试剂（5.1），充分混匀溶解；量取100mL灭菌生理盐水（5.7），加入2份2.7g±0.5g酶底物法

试剂（5.1），充分混匀溶解，分装于10个无菌试管（6.9）中，每管含10mL溶液。量取10份10mL

水样接种于上述10个含10mL溶液的试管中，加塞密封。

8.2.2受污染水样

8.2.2.1接种量为100mL时，用无菌取样瓶（6.8）量取100mL水样，加入2.7g±0.5g酶底物法试剂

（5.1），充分混匀溶解，将溶解液倒入51孔或97孔定量孔板（6.7）中（根据水样污染程度选择合

适的孔板），排除气泡后用程控定量封口机（6.6）进行封口。

8.2.2.2接种量＜100mL时，以10-4为例，取1mL水样加入100mL无菌取样瓶中，用灭菌生理盐水（5.7）

稀释定容至刻度线，混匀，再取稀释后的水样1mL，重复上述操作，以下操作按照8.2.2.1进行。

3

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8.3培养

将8.2.1和8.2.2中接种后的取样瓶、试管或孔板放入恒温培养箱中44.5℃±0.5℃培养24h±2h。

8.4对照试验

8.4.1空白试验

用灭菌生理盐水（5.7）代替样品按照8.2和8.3进行测定。

8.4.2阳性及阴性对照

8.4.2.1粪大肠菌群测定的阳性菌株为大肠埃希氏菌（Escherichia.coli）,阴性菌株为产气肠杆菌

（Enterobacteraerogenes）。

8.4.2.2标准菌株的菌悬液浓度建议使用0.3麦氏浓度值～0.4麦氏浓度值，取适量后按照8.2.2.2

进行接种，按8.3培养后，大肠埃希氏菌呈现阳性反应，产气肠杆菌呈现阴性反应。

8.5结果判读

取样瓶、试管或孔板经培养后，对照阳性比色盘（6.10），水样变黄判断为粪大肠菌群阳性，不

变色判断为粪大肠菌群阴性。记录取样瓶、试管阳性个数，51孔定量孔板（6.7）记录大孔阳性数，97

孔定量孔板（6.7）分别记录大孔和小孔阳性数。

9结果计算与表示

9.1结果计算

9.1.1接种量为300mL

根据8.5中取样瓶和试管阳性个数，查MPN表（附录B）可得每升水样中粪大肠菌群MPN数。

9.1.2接种量≤100mL

根据8.5中51孔定量孔板阳性数，查51孔MPN表（附录C）；根据8.5中97孔定量孔板大孔和小孔的

阳性数，查97孔MPN表（附录D）。再根据样品的稀释度，按公式（1）换算为每1L水样中粪大肠菌群的

浓度。

MPN值10

C...........................................................................(1)

f

式中：

C——每升水样中粪大肠菌群数，MPN/L；

MPN值——查51孔或97孔MPN表所得数，MPN/100mL；

f——接种样品的稀释度。

9.2结果表示

测定结果应保留二位有效数字，大于等于100时以科学计数法表示，单位为MPN/L。

4

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10质量保证和质量控制

10.1实验室应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。

10.2每批培养基应按本标准8.4的要求采用有证标准菌株进行阳性、阴性对照试验（见表2）。

10.3宜选用市售商品化培养基，以减少配制中产生的误差。

10.4应定期使用有证标准物质/样品进行质量控制。

10.5每批样品至少测定10%的平行双样，检测结果以算数平均值计。

表2阳性、阴性对照菌株参考表

菌株名称英文名菌株编号

大肠埃希氏菌EscherichiacoliCICC24176

产气肠杆菌EnterobacteraerogenesCICC10293或ATCC13048

11废物处理

使用后的器皿及废弃物应经121℃高压蒸汽灭菌30min处理。

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AA

附录A

（资料性附录）

酶底物法培养基的基本成分

A.1酶底物法培养基的基本成分

酶底物法培养基参照GB/T5750.12中规定的基本成分进行配制，见表A.1。

表A.1酶底物法培养基的基本成分

成分分子式或缩写含量

硫酸铵（NH4）2SO45.0g

硫酸锰MnSO40.5mg

硫酸锌ZnSO40.5mg

硫酸镁MgSO4100mg

氯化钠NaCl10g

氯化钙CaCl250mg

亚硫酸钠Na2SO340mg

两性霉素BAmphotericinB1mg

邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷ONPG500mg

4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷MUG75mg

茄属植物提取物Solanium萃取物500mg

N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐HEPES钠盐5.3g

N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸HEPES6.9g

水H2O1000mL

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BB

附录B

（规范性附录）

粪大肠菌群检数表

B.1粪大肠菌群检数表

粪大肠菌群检数表见表B.1。

表B.1粪大肠菌群检数表

100mL水样的阳性瓶数

10mL水样的阳性管数012

1L水样中粪大肠菌群数1L水样中粪大肠菌群数1L水样中粪大肠菌群数

0﹤3411

13818

271327

3111838

4142452

5183070

6223692

72743120

83151161

93660230

104069＞230

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CC

附录C

（规范性附录）

51孔定量孔板MPN表

C.151孔定量孔板MPN表

51孔定量孔板MPN表见表C.1。

表C.151孔定量孔板MPN表

阳性孔数MPN值95%可信范围下限95%可信范围上限

0﹤10.03.7

11.00.35.6

22.00.67.3

33.11.19.0

44.21.710.7

55.32.312.3

66.43.013.9

77.53.715.5

88.74.517.1

99.95.3