GB/T 18645-2002 动物结核病诊断技术

GB/'r18645-2002

前台

本标准主要是根据世界动物卫生组织[WorldOrganizationfo:八nimalHealth英),OfficeInten

tionaldesEpizootic(法),OIE]1996年颁布的诊《断试验和疫苗标准手册》(Manualofstandardsfordi-

agnostictests&.vaccines)中3.2.3,3.2.3.6的牛结核病和3.6.8的禽结核病部分的内容制定的。考虑

到我国的实际情况，对其中一些在我国还无法进行的检验技术作了删减(如:淋巴细胞增生试验;Y一干扰

素试验)

这样，一方面通过与国际同类要求尽可能一致，以使我国适应国际贸易、技术和经济交流。另一方

面，又考虑到我国的实际情况，使得技术方法具有可行性。

本标准中的生物制品应符合中华人民共和国兽《用生物制品质量标准)))(1992)的要求。

本标准的附录A、附录B、附录C都是标准的附录，附录D是提示的附录

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位:中国兽医药品监察所。

本标准卞要韶草人:毛开荣、陈向经、关孚时、罗玉峰。

中华人民共和国国家标准

动物结核病诊断技术Gs/T186452002

Diagnostictechniquesfortuberculosisofanimal

范围

木标准规定厂动物结核病的检测方法和要求

本标准适用于动物结核病检测。

2定义、符号和缩略语

本标准采用卜列钧号和缩略语:

P(,I);提纯蛋1}衍生物(purifiedproteinderivative)o

Ill:IA际iyi位(internationalunit)

3细菌学检查

3.1li%i料的采集和处理

川于细菌学检查的材料采自淋巴结及其他组织。当活畜有可疑的呼吸道结核、乳房结核、泌尿生殖

道结核、肠结核时，其痰、乳、精液、子宫分泌物、尿和粪便可作为细菌学检查的材料

对那此结核分枝杆菌PPU皮内变态反应试验阳性，但尸检时无病理学病变的动物，可从下领.uN

后、支产毛4q:、肺(特别是肺门及肺门淋巴结)、纵隔及一些肠系膜的淋巴结采集样品送检

样品应封装在无菌的容器内冷藏运送，

为f提高检出结果，样品[if采取消化浓缩法处理，处理方法见附录A(标准的附录)

3.1.1痰

对牛常可川痰进行细菌学检验。牛咯痰极少，宜在清晨采集用硬橡胶管自口腔伸人至气管内，外

端连接注射器吸取痰液。亦可取牛咳出的痰块进行检验。

痰样品稀薄时，可加人等量的4%-6%硫酸(见附录A中Al)处理，如痰样品粘稠时，则加人5倍

星的1%硫酸处理。充分摇匀后置37C、作用20min，以3000r/mind000r/min离心，沉淀物作染色

镜检、培养和动物试验

也dl用2倍量15in-20%安替福民(antiformin)溶液(见附录A中A3)处理痰液，将混合物置37C

作用11-2h后离心以灭菌生理盐水冲洗沉淀物几次后，取沉淀物染色镜检、培养和动物试验

11.2乳

怀疑有乳房结核时、可无菌采集乳汁进行检验(、一般以挤出之最后乳汁含菌量较多，旱晨挤出的乳

'j,含菌量最高)

将乳汁分置4--6支离心管中，每管10nil-，以3000r/min-4000r/min离心20mm、一30min,吸

取曰公乳脂和管底的沉淀物作染色镜检、培养和动物试验

乳汁]10ml.加酒精和乙醚各10m工及15%-2000安替福民溶液30m,l摇匀置37Y恒温箱内

1h一2h,取出加等量灭菌蒸馏水混匀离心沉淀后弃去卜清，取沉淀物作染色镜检、培养和动物试验

31.3精液和子宫分泌物

中华人民共和国国家质最监督检验检疫总局2002一02-19批准200205一01实施

cB/T18645--2002

有生殖道结核可疑时，可采集公畜精液、母畜子宫分泌物进行细菌学检杳

处理子宫分泌物，可用15%一20%安替福民溶液，混匀后静置2h^-3h,3000r/mir、一4000r/min

离心20min，弃上清，加lom工蒸馏水于沉淀物中。即可作动物试验，经1.5一2个月剖检

3门.4尿

有肾结核可疑时，可采集尿液，一般采集中段尿液，以早晨第一次尿为宜〕

如仅作染色镜检，可将尿液以3000r/min-4000r/min离心20min后，取沉淀物涂片

如作培养或动物试验，则应将尿液进行消化浓缩处理，再进行检验以免杂菌生长而影响检验结果

3.1.5粪便

有肠结核可疑时，可采集粪便进行细菌学检查，患肺结核的牛只，有时在粪便中亦可检出结核分枝

杆菌。因牛常将痰液吞咽至消化道内，随粪便排出尽量采集混有粘液或脓血的粪便。

取粪便30g，加15%20%安替福民溶液15m1一和蒸馏水55ML,混合，经2h--3h后，

3000r/min-4000r/min离心30min，倾去上清液，加10m工_蒸馏水于沉淀物中，将此液用纱布过滤

后接种于豚鼠皮下，经1.5-2个月后剖检。

或将粪便加2倍量灭菌蒸馏水磨碎，然后加氯化钠至饱和。当液体中残渣沉淀后(液体完全澄清)，

浮起的薄膜含有大量的结核分枝杆菌。取出薄膜，用等量的4写氢氧化钠(见附录A中A2)充分棍合，置

37C中3h，然后离心，取沉淀物用8%盐酸中和后.即可作染色镜检、培养和动物试验

粪便中如有粘液或脓血，可挑取粘液脓血选用任何一种消化液处理后检验。

如系纯粪便，取5g-10g，加生理盐水约3-4倍棍合后，用细铜纱网过滤，取滤液置室温中自然沉

淀，然后取_L层悬液置于另一大离心管或烧杯内，加消化液约3-4倍量·置37Y温箱111-2h,同士_法

处理后检验。

3门.6组织器官

尽量采集有结节病灶的部位。猪易患颈部淋巴结结核，亦易患肠系膜淋巴结核，且常呈钙化或「酪

样病变。家禽常在肠、脾、肝发生结核病灶，有时亦可见于肺或卵巢

病变组织需先研磨，制成乳剂，通常取组织乳剂或其他液状病料2m1,-4ml，加人等量的5%,氢氧

化钠溶液，充分振摇5min-10min，或摇至发生液化为止，液化后经3000r/min-4000r/min离心

15min-30min，沉淀物加1滴酚红作指示剂，以2mol/L盐酸中和至淡红色后，作染色镜检、培养和动

物试验

如病料为脓状或干酪状或钙化的结节病灶组织，可直接作染色镜检，往往可以检出众多的结核分枝

杆菌。但得到阴性结果时，应浓缩处理后检验

3.2检验方法

3.2.1染色镜检

3.2.1.1涂片

先在玻片L涂布一层薄甘油蛋白(鸡蛋白20m工，甘油20ml-，水杨酸钠0.4g,混匀)，然后吸取标

本滴加其卜，涂布均匀。

如检验标本为乳汁等含脂肪较多的材料，在涂片制成后，可先用二甲苯或乙醚滴加覆盖于涂片之

上，经摇动1min-2min脱脂后倾去，再滴加95%酒精以除去二甲苯，待酒精挥发后即可染色。

32.1.2染色

染色液配制方法见附录B(标准的附录)。

妻尼氏抗酸染色:处理过的被检材料涂片后，经火焰固定，加苯酚复红染色液(见附录B中BI)覆

盖，将玻片在火焰上加热至出现蒸汽(不能产生气泡)，如此热染5min(如染色液卜涸，须加适量补允)

水洗后滴加3写盐酸酒精(见附录B中B2)脱色30s-60s(至无色素脱下为日_)。水洗后以骆氏美瓶染

色液(见附录B中B3)复染1min。水洗，吸干，镜检。抗酸菌应不被盐酸酒精脱色而染成红色，其他细苗

与动物细胞可被盐酸酒精脱色而均被染成蓝色

GB/T18645-2002

3.2.1.3镜检

结核分枝杆菌在显微镜下呈细长平直或微弯曲的杆菌，长1.5pm-5m[，宽。.2pm-0.5pm,在

陈旧培养基匕或一f酪性淋巴结内的菌体，偶尔可见长达10pm或更长

3.2.2培养

32.2.1培养基配制方法见附录C(标准的附录)。

3.2.2.2被检标本经消化浓缩后吸取其沉淀物作为培养材料。初次分离，可用配氏培养基(见附录c:

巾CD1111培养基(见附录c中C2)或青霉素血液琼脂培养基(见附录c中C3)e

3.2.2.3将经过处理的标本接种到培养基上(同时作2-4份)，培养一天后，以熔化的石蜡封u，继续

培养。

3.2-2.4牛型结核分枝杆菌比人型结核分枝杆菌生长要缓慢得多初次培养牛型结核分枝杆菌时，需

36C-