DB11/T 829-2011 白菜品种纯度及真实性分子检测方法

ICS65.020.20

B21

备案号：DB11

北京市地方标准

DB11/T829—2011

白菜品种纯度及真实性分子检测方法

MethodsofidentifyingvarietalpurityandgenuinenessofChinese

cabbagebyusingmolecularmarkers

2011-11-10发布2012-03-01实施

北京市质量技术监督局发布

DB11/T829—2011

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语与定义.........................................................................1

4原理...............................................................................2

5仪器设备及耗材.....................................................................2

6试剂和溶液配制.....................................................................2

7引物选用原则及筛选方法.............................................................3

8操作步骤...........................................................................4

9检测结果...........................................................................6

附录A（规范性附录）所用溶液的配置方法..............................................8

附录B（资料性附录）白菜品种纯度检测常用的SSR引物名称及序列.......................11

附录C（资料性附录）白菜真实性鉴定常用的ISSR引物名称及序列........................13

附录D（规范性附录）白菜基因组DNA提取方法.........................................15

附录E（规范性附录）6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法...................................17

附录F（规范性附录）5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法.................................19

I

DB11/T829—2011

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由北京市农业局提出。

本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。

本标准由北京市农业局组织实施。

本标准起草单位：北京市种子管理站。

标准主要起草人：田雷、赵山普、贾希海、赵青春、彭瑞迪、王辉、福德平、高勇、张连平、黄寰。

II

DB11/T829—2011

白菜品种纯度及真实性分子检测方法

1范围

本标准规定了结球白菜和不结球白菜种子品种纯度及真实性鉴定的SSR、ISSR分子标记检测方法和

对检测结果的判定标准。

本标准适用于结球白菜和不结球白菜常规种子、杂交种子及其亲本的品种纯度和真实性鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验

GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定

3术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

SSR标记simplesequencerepeatmarker，SSR

简单重复序列（SSR）,又称短串联重复序列或微卫星序列，它是一类以1bp～5bp的短核苷酸序列为

基本单位串联重复状分布于整个基因组内的重复序列。

3.2

ISSR标记intersimplesequencerepeatmarker，ISSR

内部简单重复序列(ISSR)，是利用包含重复序列并在3’端或5’端锚定的单寡聚核苷酸引物对基因

组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。

3.3

聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR

一种用于在体外扩增DNA序列的技术程序。模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶的作

用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发

生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，使引物得以延

伸。然后不断重复变性、退火和延伸这一循环过程，使欲扩增的基因片段呈几何倍数扩增。

3.4

引物primer

1

DB11/T829—2011

在DNA合成反应时，提供3’－OH末端作为DNA合成的起点,能够与DNA模板特定区域特异结合的多核苷

酸单链。

4原理

简单重复序列（SSR）和内部简单重复序列(ISSR)广泛分布于白菜基因组的不同位置上。每个位点

的重复单位或序列会因为品种的不同而存在遗传结构上的差异，这些差异表现为多态性。针对重复单位

或序列的不同，设计相应的SSR引物和ISSR引物，通过PCR技术进行扩增、电泳、染色，形成白菜品种的

SSR和ISSR指纹图谱，进行白菜品种纯度和真实性的鉴定。

5仪器设备及耗材

5.1仪器设备

5.1.1天平(感量0.0001g、0.001g、0.01g、0.1g）。

5.1.2水浴锅(0℃～100℃）。

5.1.3微波炉（额定功率800W）。

5.1.4酸度计。

5.1.5磁力搅拌器。

5.1.6高速台式离心机（12000r/min）。

5.1.7高压灭菌锅。

5.1.8冰箱（最低温度-20℃）。

5.1.9微量加样枪（0.5µL～10µL,20µL～200µL,100µL～1000µL）。

5.1.10PCR扩增仪。

5.1.11紫外成像仪。

5.1.12紫外分光光度计。

5.1.13水平仪。

5.1.14高压电泳仪（0V～3000V、0mA～400mA、额定功率400W）。

5.1.15电泳槽。

5.1.16染色盒（55cm×38cm×8cm）。

5.1.17水平摇床。

5.1.18胶片观察灯。

5.1.19数码照相机。

5.2耗材

离心管（0.2mL、0.5mL、1.5mL、2.0mL）、枪头（10µL、200µL、1mL）、96孔PCR板、一次性手

套、夹子、吸水纸、玻璃棒等。

6试剂和溶液配制

6.1试剂

除另有规定外，仅使用分析纯试剂。

6.1.1乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2）。

2

DB11/T829—2011

6.1.2三羟甲基氨基甲烷（Tris）。

6.1.3盐酸（HCl）。

6.1.4硼酸（H3BO3）。

6.1.5十二烷基硫酸钠（SDS）。

6.1.6氯化钠（NaCl）。

6.1.7乙酸钠（NaAc）。

6.1.8Tris-饱和酚。

6.1.9三氯甲烷。

6.1.10异戊醇。

6.1.11异丙醇。

6.1.12无水乙醇。

6.1.13四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），缩略为dNTP。

6.1.14TaqDNA聚合酶。

6.1.1510×PCR缓冲液。

6.1.16DNA标准分子量标记（Marker）。

6.1.17SSR引物。

6.1.18ISSR引物。

6.1.19丙烯酰胺。

6.1.20N，N’－亚甲基双丙烯酰胺。

6.1.21N，N，N’，N’－四甲基乙二胺（TEMED）。

6.1.22过硫酸铵[(NH4)2S2O8]。

6.1.23尿素。

6.1.24亲水硅烷（bind-silane）。

6.1.25疏水硅烷（repel-silane）。

6.1.26甲酰胺。

6.1.27溴酚蓝。

6.1.28二甲苯青FF。

6.1.29冰乙酸（HAc）。

6.1.30硝酸银（AgNO3）。

6.1.31甲醛。

6.1.32琼脂糖。

6.1.33蔗糖。

6.1.34溴化乙锭（EtBr）。

6.1.35超纯水。

6.1.36蒸馏水。

6.2溶液配制

按照附录A的规定配制溶液。

7引物选用原则及筛选方法

7.1引物选用原则

3

DB11/T829—2011

7.1.1应优先选用核心引物库中的引物。当不能满足需求时，可以利用已经公开发表的引物，也可以

自行筛选引物。

7.1.2当自行筛选适宜品种纯度检测的SSR引物时，应遵循扩增后的杂交种SSR电泳谱带含有双亲互

补带型，条带清晰、重复性好的原则。

7.1.3当自行筛选适宜真实性鉴定的ISSR引物时，应遵循扩增后的ISSR电泳谱带多态性高，条带清

晰、重复性好的原则。

7.2引物筛选方法

7.2.1自行筛选用于品种纯度检测的SSR引物时，选取有代表性的杂交种种子10粒及父母本种子各5

粒。利用一系列SSR引物进行试验，根据扩增后的杂交种电泳谱带含有双亲互补带型，条带清晰、重复

性好的原则，确定适宜的引物。

7.2.2自行筛选用于真实性检测的ISSR引物时，选取有代表性的常规种子或杂交种种子5粒～10粒

及至少10个以上不同品种。利用一系列ISSR引物进行试验，根据扩增后的常规种或杂交种电泳谱带多

态性高，条带清晰、重复性好的原则，确定适宜的引物。

7.3核心引物库

7.3.1白菜品种纯度检测常用的SSR引物名称及序列参见附录B。

7.3.2白菜真实性鉴定常用的ISSR引物名称及序列参见附录C。

8操作步骤

8.1纯度检测

8.1.1样品DNA的提取

使用种子直接提取DNA进行检测的样品数量，按照GB/T3543.5的规定，从送检样品中随机数取

100粒种子作为试样；使用幼苗提取DNA进行检测的样品数量，按照GB/T3543.4的规定，从净种子中

随机数取一定数量种子（保证100株幼苗）作为试样，进行幼苗培养。

按照附录D规定的方法提取样品DNA。

8.1.2SSR-PCR扩增

8.1.2.1SSR-PCR反应体系

SSR-PCR反应的总体积为20uL，反应体系见表1。

表1SSR-PCR反应体系

试剂SSR-PCR终浓度SSR-PCR体积

超纯水—10.7µL

10×PCR缓冲液1×2µL

25mmol/L氯化镁溶液2.5mmol/L2µL

2.5mmol/LdNTP混合溶液0.25mmol/L2µL

10µmol/L上、下游引物溶液0.5µmol/L1µL

5U/µLTaq酶1.5U/管0.3µL

DNA模板10ng/µL～50ng/µL2µL

4

DB11/T829—2011

表1SSR-PCR反应体系（续）

试剂SSR-PCR终浓度SSR-PCR体积

总体积—20µL

备注如果10×PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶

液，加等体积超纯水。

8.1.2.2SSR-PCR反应程序参数

SSR-PCR反应程序参数见表2。

表2SSR-PCR反应程序参数

程序SSR