DB37/T 3572-2019 牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程

ICS65.020.01

B40

DB37

山东省地方标准

DB37/T3572—2019

牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规

程

CodeofpracticefordetectionofA2typeofβ-casein(A2milk)incow'smilk

2019-05-29发布2019-06-29实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T3572—2019

目次

前言II

1范围1

2规范性引用文件1

3术语和定义1

4检测原理1

5主要试剂配制2

6主要仪器设备2

7质谱检测及数据处理参数2

8检测方法2

8.1样本采集2

8.2蛋白提取2

8.3蛋白质的消化2

8.4质谱鉴定3

9结果判定3

9.1SDS鉴定3

9.2A2型β-酪蛋白的判定3

10废弃物的处理3

11检测过程中防止交叉污染的措施3

附录A（资料性附录）主要试剂配制4

附录B（资料性附录）主要仪器设备6

附录C（资料性附录）蛋白检测参数及结果8

I

DB37/T3572—2019

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。

本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东奥克斯畜牧种业有限公司、山东省畜牧总

站、大同市南郊区四方高科农牧有限公司、中国农业大学、江苏省农业学院畜牧研究所。

本标准主要起草人：黄金明、王秀革、鞠志花、姜强、王玲玲、张思聪、张亚冉、魏晓超、高亚平、

刘文浩、高运东、侯明海、杨国瑞、戴蕴平、仲跻峰。

II

DB37/T3572—2019

牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程

1范围

本标准规定了牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测方法。

本标准适用于牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

GB/T19495.2—2004转基因产品检测实验室技术要求

GB/Z35959—2018液相色谱-质谱联用分析方法通则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

A2型β-酪蛋白A2β-casein；A2CSN2

β-酪蛋白由224个氨基酸（含有15个氨基酸的信号肽）组成，具有不同的变体型（A1、A2、A3、B、

C、E、F、H1、I），当第51位、52位、82位、103位、108位、121位、137位、167位氨基酸分别为谷氨

酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸时，称为A2型β酪蛋白。

3.2

A2奶A2milk

所含β酪蛋白为A2型的牛奶称为A2奶。

3.3

质谱法Massspectrometry；MS

试样被电离后，形成不同质荷比的离子，根据这些离子的质量数和相对丰度分析试样的方法。

3.4

质荷比Mass-to-chargeratio

离子的质量m与其所带的电荷数z之比，以m/z表示。

4检测原理

1

DB37/T3572—2019

β-酪蛋白变体型对应不同的氨基酸突变位点（p.51E＞K、p.52E＞K、p.82P＞H、p.103L＞I、

p.108M＞L、p.121H＞Q、p.137S＞R、p.167P＞L）（参考序列：GenBankAAA30431.1），而不同氨

基酸之间存在分子量差异。利用质谱分析技术，根据质荷比差异将样品蛋白质中存在氨基酸突变的肽段

鉴定出来，从而确定氨基酸突变位点，实现对不同变体型β-酪蛋白检测的目的。

5主要试剂配制

实验所用水为符合GB/T6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为121℃，1.034×105Pa压力，蒸汽灭

菌20min。试剂配制见附录A。

6主要仪器设备

见附录B。

7质谱检测及数据处理参数

见附录C。

8检测方法

8.1样本采集

8.1.1待检测的新鲜牛奶

每头奶牛采集新鲜牛奶（排除头奶或末乳）50mL，充分混匀后，-80℃保存。

8.1.2待检测的商品化奶粉

包装未开封，常温储存。

8.2蛋白提取

8.2.1从-80℃取出牛奶样本，常温解冻后充分混匀，取样50μL，或称取奶粉样本30mg。

8.2.2向上述样品中加入500μL裂解液【8M尿素，30mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）】。冰上

裂解10min。离心，4℃，20000g，30min。取上清，避免吸到油脂。

8.2.3加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度10mM。56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM）

至终浓度55mM，暗室静置1h。

8.2.4使用考马斯蓝染色法（bradford法）对蛋白质进行定量。

8.2.5对定量后的蛋白质进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）鉴定（如附录C.1）。

8.3蛋白质的消化

8.3.1每个样品取20μg蛋白，加入到10K超滤管中，14000g，4℃，离心40min，弃废液。

8.3.2加入200μL的25mM碳酸氢铵（NH4HCO3），14000g，4℃，离心40min，弃废液。

8.3.3重复上述步骤两遍。

8.3.4加入1μg/μL的胰蛋白酶（Trypsin）和V8蛋白酶（Glu-C）各1μL，37℃水浴24h。离

心收集消化后的肽段。

2

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8.3.5真空抽干消化后的肽段。

8.3.60.1%甲酸（FA）复溶肽段。

8.4质谱鉴定

8.4.1将肽段上机检测。使用Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱质谱仪检测肽段信号，液相及质谱检

测参数详见附录C表C.1、表C.2、表C.3。

8.4.2质谱扫描完毕，得到质谱原始文件。将质谱原始文件输入到PD（ProteomeDiscoverer1.3,

Thermo）软件后，筛选质谱谱图。筛选参数见附录C表C.4。

8.4.3PD提取后的谱图用Mascot软件进行搜索，搜索结束后，PD软件根据Mascot软件搜索结果输出

鉴定结果。检索参数见附录C表C.5，鉴定的肽段见附录C表C.6。

9结果判定

9.1SDS鉴定

将从样品中提取的蛋白质进行SDS分离鉴定，检测蛋白条带是否清晰无降解。条带清晰，表示

可用于后续检测，否则重新取样鉴定。见附录C.1。

9.2A2型β-酪蛋白的判定

根据质谱鉴定结果，当待测样品的8个氨基酸突变位点分别为p.51E、p.52E、p.82P、p.103L、

p.108M、p.121H、p.137S、p.167P时，检测结果表述为