NY/T 537-2002 猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术

11.220

器1

中华人民共和国农业行业标准

NY1T537-2002

猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术

neumoma

Diagnostictechniquesforactinobaclluspleurop

2002一08一27发布2002一12一01实施

中华人民共和国农业部发布

303

xY/T537-2002

前言

猪放线杆菌胸膜肺炎(简称APP)又称猪接触性传染性胸膜肺炎(porcinecontagiouspleuropneu-

monia),是猪的一种呼吸系统重要传染病。世界各国均有发生。本病主要引起猪的一种伴有胸膜炎的出

血性坏死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速致死，可发生于任何年龄的猪只。尤其在集约化养猪场

一旦发生会造成重大经济损失。

国外用于本病的血清学诊断方法有凝集反应、琼脂扩散、间接血凝、补体结合((CF)以及酶联免疫吸

附试验(ELISA)等。而最常应用的血清学诊断方法是CF和ELISA试验。细菌的鉴定除用常规方法外，

也有用聚合酶链反应(PCR)方法诊断。型的鉴定常规方法有琼脂扩散和间接血凝等试验方法，近来亦有

应用核糖核酸分型的试验报道。

本标准的附录A,附录B、附录C、附录D、附录E,附录F、附录G,附录H均为规范性附录。

本标准由农业部畜牧兽医局提出。

本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位:农业部动物检疫所。

本标准主要起草人:朱士盛、杜文金、徐瑞、王新。

NY/T537-2002

猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术

1范围

本标准规定了猪放线杆菌胸膜肺炎的诊断技术。

本标准酶联免疫吸附试验用于筛选试验，包括产地检疫、流行病学调查和无本病健康猪群的建立

补体结合试验适用于口岸进口猪检疫。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的

修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准.然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是

否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB4789.28-1994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂

3病原学检查

3.1材料准备

3.1.1培养苍

3.1.1.1营养琼脂:按GB4789.28-1994中4.7规定配制。

3.1.1.2血琼脂:按GB4789.28-1994中4.6规定配制，其中4.6.1成分用4.7.1成分代替。

3.1.1.3尿素琼脂:按GB4789.28-1994中3.15规定配制。

3.1.1.4巧克力琼脂:制备方法见附录A,

3.1.1.5类胸膜肺炎微生物((PPLO)琼脂:制备方法见附录A,

3.1.2其他材料

3.1.2.1灭菌棉拭子。

3.1.2.2革兰氏染色液:按GB4789.28-1994中2.2规定制备和染色。

3.1.2.3糖发醉管:按GB4789.28-1994中3.2规定制备，3.2.1成分中蛋白陈改为多聚蛋白陈,pH

调至7.2，另外，按0.5%加人糖的同时，按0.01%加人辅酶A后，分装于有倒置小管的试管内，

68.94kPa(1150C蒸汽)灭菌15min,

3.1.2.4鸡表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌。

3.2病料采集

3.2.1活体病料采集:用棉拭子伸人鼻腔采集分泌物，放人无菌试管中立即送往实验室供分离。

3.2.2死后病料采集:无菌采集具有典型病变的肺气管、肺门淋巴结、鼻腔分泌物，在最急性感染死亡

的小猪，除采集上述病料外，还可取肝、脾病料。

3.2.3样品运送:采集的样品，应在4'C条件下24h内送到实验室。

3.3病原分离

将样品按常规分离要求直接接种到血琼脂(见3.1.1.2)表面，再用鸡表皮葡萄球菌作交叉划线，于

37'C含500^'10%二氧化碳(COQ)下培养。继代培养用巧克力琼脂(见第A.1章)和PPLO琼脂(见第

A.2章)。

NY/T537一2002

3.4病原鉴定

3.4.1培养形态及染色特性

3.4.1.1于血琼脂平板培养24h--48h,胸膜肺炎放线杆菌(APP)为露珠样的小菌落,ft径1nom-

2mm,

3.4.1.2多数菌株产生R溶血带，靠近鸡表皮葡萄球菌菌苔的菌落较大，随着与葡萄球菌生长线的距

离增加而变小或不生长，即所谓“卫星现象”。

3.4.1.3取典型菌落作革兰氏染色，应为革兰氏阴性小球杆菌，两极着色继代培养中呈明显多形态

幼龄培养物中偶有成丝状。

3.4.1.4被分离菌具有以下特点即可初步判定为猪胸膜肺炎放线杆菌:

a)染色镜检为革兰氏阴性杆菌或多形态;

b)在血琼脂培养基仁生长具有溶血现象;

。)生长培养需要v因子，即具有“卫星现象”

3.4.2生化特性

3.4.2.1v因子需要测定:按3.3接种和3.4.1观察。有“卫星现象”为需要v因子。

3.4.2.2尿素酶试验:将分离菌接种于尿素琼脂(见3.1.1.3)斜面上，于37-C温箱中培养3h-v12h,

斜面变粉红色者为尿素酶试验阳性。

3.4.2.3溶血性:将待检菌接种于血琼脂，37-C培养18h-24h后观察结果。多数菌株产生Q溶血带。

3.4-2.4过氧化氢酶试验:取干净的载玻片，在上面滴1滴3肠过氧化氢溶液，挑取一环斜面培养的试

验菌，在过氧化氢溶液中混匀，若有气泡出现则为过氧化氢酶试验阳性。

3.4.2.5CAMP'’试验:在血琼脂平皿上方用具有R溶血的金黄色葡萄球菌划一横线，在此横线下方，

隔0.3cm--0.5cm处划垂直线接种被检菌，置37℃培养24h,横线与垂直线相邻空间的溶血区明显增

大者为阳性。

3.4.2.6糖发酵试验:从琼脂斜面上挑取少量待检菌培养物，接种于搪发酵管(见3.1.2.3)培养液内，

于37C温箱内培养2d-3d，能分解某种糖会产酸或产酸产气。产酸时，可使颜色变黄，产气者于倒置小

发酵管内出现气泡。

3.4-2.7被检菌生化特性鉴定详见表1,

3.4-2.8被检菌生长特性测定，凡CAMP反应、尿素酶试验均为阳性，能分解D一木糖、甘露醇，不分解

棉子糖、阿拉伯胶糖者，并具有3.4.1.4特性的，即可确认为猪胸膜肺炎放线杆菌。

表1生化特性鉴定

放线杆菌放线杆菌放线杆菌放线杆菌放线杆菌

胸膜肺炎放副猪嗜

特性线杆菌分类群分类群分类群分类群分类群血杆蔺

MinorCDEF

V因子需要V+十+V(60)++

尿素酶++

溶血性VV

++

过氧化氢酶一(12)一(13)+

CAMP千

葡萄糖产酸++++V(30)++

阿拉伯胶糖++(86)

乳糖一(6)十(91)+V(30

I)对B族9溶血性链球菌的初步鉴定

NY/T537-2002

表1(续)

放线杆菌放线杆菌放线杆菌放线杆菌放线杆菌

胸膜肺炎放副猪嗜

特性分类群分类群分类群分类群分类群

线杆菌血杆菌

MinorcDEF

甘露醇++

蔗糖十+++(10)++

木糖+(88)一(30)V(50)一(25)

半乳糖++(87)++++

甘露糖++++一(10)++

棉子糖十十{

山梨醇+

麦芽糖+斗++V(20)++

注:.V‘”为可变;“十”为阳性;“一”为阴性;(数字)为百分数.

3.4