DB15/T 2835-2022 马驽巴贝斯虫检测 PCR法

ICS65.020.30

CCSB41

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2835—2022

马驽巴贝斯虫检测PCR法

PCRmethodfordetectionofbabesiosiscaballi

2022-12-08发布2023-01-08实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2835—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。

本文件起草单位：中华人民共和国二连海关、内蒙古自治区市场监督管理评审查验中心。

本文件主要起草人：陈少博、杨帆、王伊琴、常鸿、包勇敢、荆文魁、腾克、赵治国。

I

DB15/T2835—2022

马驽巴贝斯虫检测PCR法

1范围

本文件规定了马驽巴贝斯虫PCR法和实时荧光PCR检测方法。

本文件适用于马属动物马驽巴贝斯虫病的分子生物学诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

马驽巴贝斯虫babesiosiscaballi

马驽巴贝斯虫是引起马驽巴贝斯虫病的病原体，是一种寄生于马、驴、骡、斑马等马属动物红细胞

内的血液原虫。

聚合酶链式反应polymerasechainreaction；PCR

用于扩增位于已知序列之间DNA（deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸）的方法。模板DNA经过

高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分别于模板DNA两

条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP（deoxyribonucleoside

triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸）为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这

一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增，经25～30个扩增循环，扩增倍数达到106。

实时荧光PCRreal-timePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。

Ct值cyclethreshold

1

DB15/T2835—2022

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

bp:碱基对(basepair)

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromide)

DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)

FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)

PCR:聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

TAMRA:羧基四甲基罗丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine)

Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]

5试剂与材料

水：符合GB/T6682的要求。

DNA提取试剂盒。

CTAB。

Tris-HCl(pH8.0)。

NaCl。

EDTA。

蛋白酶K溶液(20mg/mL)。

三氯甲烷。

异丙醇。

75%乙醇。

Taq酶。

dNTP（2.5mmol/L）。

PCRbuffer。

DNA分子量标准（DNAMarker）（50bp～500bp）。

实时荧光PCR预混液。

阳性对照样品：采用已知含有马驽巴贝斯虫的DNA，或经测序确认的阳性质粒。见附录