DB12/T 506-2014 大豆转基因成分筛查方法

ICS65.020.01

B04DB12

天津市地方标准

DB12/T506—2014

大豆转基因成分筛查方法

Screeningmethodforgeneticallymodifiedsoybean

2014-04-22发布2014-07-20实施

天津市质量技术监督局发布

DB12/T506—2014

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由天津市质量技术监督局提出。

本标准起草单位：天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。

本标准主要起草人：黄凤军、陈杰、朱珠、李建、马强、赵新、龙起成、陈慧。

本标准2014年04月首次发布。

I

DB12/T506—2014

大豆转基因成分筛查方法

1范围

本标准规定了大豆中转基因成分定性PCR筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。

本标准适用于大豆及其制品中Lectin内标准基因、CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4-epsps基

因、Bt基因和bar/pat基因的定性PCR筛查检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求

农业部2031号公告—19—2013转基因植物及其产品检测抽样

农业部1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

Lectin基因Lectingene

编码大豆凝集素的基因。

3.2

CaMV35S启动子35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus（CaMV）

来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。

3.3

NOS终止子terminatorofnopalinesynthase（NOS）gene

来自胭脂碱合成酶基因NOS的终止子。

3.4

CP4-epsps基因5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasegenederivedfromAgrobacterium

sp.CP-4。

来源于土壤农杆菌株系（Agrobacteriumsp.）CP4株系一段可编码5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸

合酶的基因。

3.5

Bt基因Bt（Bacillusthuringiensis）gene

来源与苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt），可表达一种杀虫晶体蛋白的基因，常

见的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因。

3.6

bar/pat基因bialaphosresistancegene/phosphinothricinacetyltransferasegene

1

DB12/T506—2014

bar基因来源于土壤吸水链霉菌（Streptomyceshygroscopicus），pat基因来源于绿产色链霉菌

（Streptomycesviridochromogens），均编码膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinthricinacetyltransferase，PAT），

该酶具有对除草剂草丁膦（glufosinate）的耐受性。bar基因和pat基因具有较高的同源性。

4检测方法

4.1试剂和材料

4.1.1实验用水为重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。

4.1.2琼脂糖。

4.1.310g/L溴化乙锭溶液：称取1.0g溴化乙锭（EB），溶于100mL水中，避光保存。

注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。

4.1.410mol/L氢氧化钠溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠（NaOH），溶解后再加水定容

到200mL。

4.1.5500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）：称取18.6g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），

加入70mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液（4.1.4），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠

溶液（4.1.4）调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。

4.1.61mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶

解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20

min。

4.1.7TE缓冲液（pH8.0）：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（4.1.6）和2mL乙二

铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。

4.1.850×TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用300mL水加热搅拌溶解后，

加100mL乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用

时用水稀释成1×TAE。

4.1.9加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基

苯腈蓝，用10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，用30mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100

mL，在4℃下保存。

4.1.10DNA分子量标准：可以清楚的区分50bp～1000bp的DNA片段。

4.1.11dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸

溶液等体积混合。

4.1.12TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液及25mmol/L氯化镁溶液。

4.1.13引物：大豆内标准基因和转基因大豆外源基因检测时所用的引物序列见表1。

表1大豆内标准基因和转基因大豆外源基因引物序列

检测基因引物序列扩增片段长度基因性质

lec-1672F：5′-GGGTGAGGATAGGGTTCTCTG-3′

Lectin210bp内标准基因

lec-1881R：5′-GCGATCGAGTAGTGAGAGTCG-3′

35S-F：5′-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3′

CaMV35S195bp外源基因

35S-R：5′-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3′

NOS-F：5′-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3′

NOS