T/NAASS 057-2023 牛4型疱疹病毒间接酶联免疫吸附试验 抗体检测技术规程

范围:本文件规定了牛4型疱疹病毒间接酶联免疫吸附试验抗体检测的术语和定义、间接酶联免疫吸附试验。 本文件适用于牛血清、牛血浆、牛奶样本中牛4型疱疹病毒病抗体的检测，可用于该病的实验室检测、诊断和流行病学调查; 主要技术内容:3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。牛4型疱疹病毒Bovine herpesvirus 4，BoHV-4牛4型疱疹病毒属于疱疹病毒科丙型疱疹病毒亚科猴病毒属，是导致牛生殖障碍的主要病毒之一。间接酶联免疫吸附试验Indirect enzyme linked immunosorbent assay, iELISA间接ELISA方法是先将抗原结合到ELISA板上，随后分两步进行检测，首先加入检测抗体与抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色,由呈色反应来测定抗原。4间接酶联免疫吸附试验操作试验准备实验环境、仪器与设备、洗液的制备、稀释液的制备、示踪剂工作液的配制按照试剂盒说明书规定执行。实验环境的生物安全条件应符合GB/T 19489的要求，稀释用蒸馏水应符合GB/T 6682的要求。检测样品新鲜或冷冻的血清、血浆、奶样均可直接用于检测。奶样准备：4000rpm/min离心20 min，利用巴斯德吸管吸取中间层液体，注意不要接触到下层的细胞沉淀物。未稀释的脱脂奶可直接加入微孔板。操作程序使用前将所有试剂恢复至21 ℃±3 ℃，轻轻摇动或旋转，使试剂混合均匀。4.3.1准备取出微孔板，并在操作记录表上标记样品的位置。如果使用微孔板的一部分，则只需取出足够检测样品的条数。未使用的微孔板条用锡箔纸包好，保持干燥与密封，2 ℃～8 ℃保存。4.3.2血清或血浆稀释血清或血浆按试剂盒要求稀释，避免使用溶血样品和具有凝结物的样品。在试剂盒的微孔板中按要求加入样品、稀释液，吹打混匀。4.3.3对照样品（阳性血清和阴性血清）和示踪剂稀释阳性血清、阴性血清及示踪剂应用稀释液按试剂盒要求进行稀释。4.3.4加样每孔加入样品（血清、血浆或奶样），一孔一样。阳性血清加入A1孔，阴性血清加入A2孔，示踪剂加入A3孔，样品1加入A4孔，以此类推。4.3.5感作将微孔板封板后，按照试剂盒说明书中指定的时间进行室温孵育。4.3.6洗涤弃去微孔板中液体，用300 μL左右的洗涤液洗涤每个板孔3次。在每一次洗涤后，甩去每个板孔中的液体，在洗涤时以及在加入下