DB35/T 1559-2016 柑橘半穿刺线虫检疫鉴定方法

ICS65.020.01

B16

DB35DB35/T1559-2016

福建省地方标准

DB35/T1559—2016

柑橘半穿刺线虫检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofTylenchulussemipenetransCobb.

2016-04-06发布2016-07-06实施

福建省质量技术监督局发布

DB35/T1559-2016

前言

本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。

本标准由中华人民共和国福建出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、福建农业职业技术院、福建农林大学。

本标准主要起草人：林星辉、林谷园、章淑玲、高小倩、李敏。

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柑橘半穿刺线虫检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了柑橘半穿刺线虫鉴定依据、仪器用具及药品、现场检疫和抽样、实验室检疫鉴定、

形态鉴定特征、结果判定以及样本和样品保存与处理。

本标准适用于植物根系、土壤及生长介质中柑橘半穿刺线虫的检疫鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB15569农业植物调运检疫规程

SN/T2122－2008进出境植物及植物产品检疫抽样

3鉴定依据

3.1柑橘半穿刺线虫基本信息

中文名：柑橘半穿刺线虫

学名：TylenchulussemipenetransCobb,1913

柑橘半穿刺线虫隶属于线虫门Nematoda(Rudolphi,1808)Lankester,1877、侧尾腺纲Secernentea

vonLinstow,1905、垫刃目TylenchidaThorne,1949、环总科CriconematoideaTaylor，1936、环科

Criconematoidae（Taylor,1936）Thorn,1949、半穿刺亚科TylenchulinaeSkarbilovich,1947、半穿

刺线虫属TylenchulusCobb,1913。

柑橘半穿刺线虫为营定居性寄生，以二龄幼虫作为侵染虫态，主要从寄主的营养根根尖侵入。其传

播途径主要依靠土壤、生长介质土和带根苗木等寄主植物材料的调运。

柑橘半穿刺线虫的其他信息参见附录B。

3.2方法原理

将现场检疫中采集的植物根系、土壤以及生长介质样本，送实验室经解剖检查、根系染色检查、贝

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尔曼漏斗法分离获得线虫、制成临时或永久玻片，显微镜下对成熟的雌虫、雄虫、二龄幼虫主要鉴定特

征仔细观察并测量数据，依据本标准描述的柑橘半穿刺线虫形态鉴定特征、测量数据和基本生物学信息，

按系统分类方法，鉴定其生物学种类。

4仪器、用具及药品

4.1仪器及用具

体视显微镜、显微镜、倒置显微镜、电子天平、试管、漏斗、漏斗架、橡皮管、止水夹、分离浅盘、

面巾纸、培养皿、剪刀、刀片、烧杯、载玻片、盖玻片、酒精灯、挑针、记号笔、加热板、打孔器等。

4.2药品

40%甲醛、甘油、石蜡、氯酸钠、酸性品红、95%乙醇、三乙醇胺、蒸馏水等。

5现场检验和抽样

5.1现场检验

在田间或温室（大棚）种植地、销售场地对柑橘半穿刺线虫的寄主植物进行检查，查验植物体的生

长状况（长势），叶片是否有黄化褪绿、变小变薄，枝梢变短，开花减少，座果稀疏，花、果、叶脱落，

树势衰退等症状。采集上述可疑的植物根部和根际生长介质，送实验室作线虫分离。

5.2抽样

当田间或温室（大棚）地栽的植物没有明显症状表现时，可采用对角线、棋盘式、平行跳跃式或拉

链式的随机取样方法，确定取样点；当田间或温室（大棚）地栽的植物表现明显症状时，对发病点的病

株根部及其周围的土壤进行取样。国内省际间调运的植株抽样数量应符合GB15569的规定；进出境的

植株抽样数量应符合SN/T2122－2008的规定。

5.3样品制作及保存

选定取样植株，在树冠滴水线以内，刨除表土、杂草，采集分布于10cm～45cm土层的营养根及根

系土壤。每株5点取样混合为一个样本，每株至少采集500g的根与根际土壤。将样本装入自封袋中，扎

紧保持湿润，并附上标签，记录寄主、地点、症状特点及采集时间。在实验室对样本进行线虫分离与观

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察。未及时分离的样本，应放置在4℃冰箱保存，保存时间不宜超过1个月。

6实验室检疫鉴定

6.1线虫分离

6.1.1解剖检查

选择植株营养根，清除表面土壤，将根剪成2cm～3cm长的小段，置于装有适量水的培养皿中，

在显微镜下用解剖针撕开可疑的营养根，挑取其中的线虫，按附录E的规定制成临时玻片，用显微镜

检查与鉴定。

6.1.2染色检查

采用次氯酸钠-酸性品红染色法对根组织柑橘半穿刺线虫染色检查。按附录F进行染色，冷却后以酸

性甘油为浮载剂于显微镜下进行镜检。

6.1.3贝尔曼漏斗法分离

根际土壤中的柑橘半穿刺线虫各虫态分离采用改良贝尔曼漏斗法。用一小段皮管接于漏斗颈上，

用止水夹夹紧皮管底部，分离线虫时在分离筛底部垫一张纱布或滤纸。将栽培介质和土壤铺在纱布或滤

纸上，将筛置于漏斗上，加水至没过样本表面。24h～48h后，用培养皿收集漏斗底部的水样，在显微

镜下检查，挑取线虫，按附录E规定的方法制成临时玻片。检查鉴定。

6.2显微镜观察、拍照和测量

对雌虫、雄虫、二龄幼虫的整体形态、唇区形态、食道腺形态、尾部形态及雄虫交合刺等鉴定特征

进行显微观察、拍照。每张照片应加相应标尺。需测量记录的项目和参数主要有：

a）体长；

b）最大体宽；

c）口针长；

d）尾长；

e）体前端至食道与肠连接处的距离；

f）泄殖腔至精巢最前端距离；

g）排泄孔至头端的距离。

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7形态鉴定特征

7.1形态特征

7.1.1未成熟雌虫形态特征描述

虫体蠕虫形，有清晰的环纹；头部锥圆、光滑、连续，无唇盘，头架中等硬化；口针具有圆形、发

达的基部球，背食道腺开口位于基部球后，约4μm；食道前体部长柱形，中食道球发达、卵圆形、有

发达的瓣，峡部细长柱形，后食道腺囊状，略向腹面偏移且与肠交界清楚，有贲门瓣；排泄孔显著，紧

位于阴门前，其到头端距离是体长在80.2（76.9～84.2）%，排泄管清楚；阴门位于虫体近后端部，阴

门唇厚，单卵巢、前伸、未发育成熟，有几个卵母细胞，无后阴子宫囊；直肠和肛门退化，尾端钝圆。

未成熟雌虫形态特征参见附录A

7.1.2成熟雌虫形态特征描述

成熟雌虫：虫体颈部呈不规则的弯曲，口针纤细，角质膜薄；虫体后部呈不规则明显膨大、最宽处

约68μm～100μm角质膜厚、无环纹，阴门以后的虫体呈指状并朝腹面弯曲，长为36（32～43）μm；

排泄孔和阴门位于虫体后部，排泄孔位于阴门前36（32～43）μm，距头端的距离是体长的82.5（79.4～

85.0）%；卵巢盘卷，受精囊有精子，子宫内有单个的卵；无直肠和肛门。

成熟雌虫形态特征参见附录A

7.1.3雄虫形态特征描述

虫体显蠕虫形，细小，热杀死后虫体前部直，尾部略弯，侧区不明显；头部光滑、锥圆，骨质化；

口针和食道退化，口针基部球小，中食道球弱、纺锥形，后食道腺溢缩；排泄孔位于虫体中后部；单精

巢、前伸，无交合伞，交合刺较细、弓状、长度为14μm～18μm，引带长3μm～4μm，尾长圆锥形、

端圆。

雄虫形态特征参见附录A

7.1.4二龄幼虫形态特征描述

虫体直或弯，侧区不清楚，刻线2条；头部、口针和食道特征似未成熟雌虫，背食道腺开口位于口

针基本球后，食道腺略覆盖肠；排泄孔位于体中后部；无直肠和肛门，尾长圆锥形、端尖到圆。

二龄幼虫的形态特征图见附录A。

7.2测计数据

柑橘半穿刺线虫测计数据（参考数值）见附录C

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8结果判定

以雌成虫、雄成虫、二龄幼虫为主要观测对象，将观察、测量获得的各鉴定特征作为检疫鉴定的依

据，形态特征符合本标准第8章形态鉴定特征和附录C虫体测计数据应判定为柑橘半穿刺线虫。其附

录B柑橘半穿刺线虫的相关资料、附录D半穿刺线虫属种类鉴定检索表等信息可供参考。

9标本和样品保存与处理

9.1保存方法

9.1.1标本保存

将分离鉴定为柑橘半穿刺线虫按附录E的规定进行灭活、固定并制成永久玻片保存。标签上应注

明样品编号、寄主、产地、制作人和制作时间。

9.1.2寄主样品保存

对已鉴定出带有柑橘半穿刺线虫的植物材料，应登记、保存，并做好标识，标明样品基本情况，如：

样品编号、截获人、截获日期、寄主名称、运输工具名称、产地等。

9.2保存时间

含有柑橘半穿刺线虫的样品，保存至少6个月备用。

9.3处理

保存期满后，含有柑橘半穿刺线虫的样品应作灭活处理。

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附录A

（资料性附录）

柑橘半穿刺线虫形态特征图