GB/T 36833-2018 马铃薯X病毒检疫鉴定方法

ICS65.020.01

B16

国

中华人民共和国国家标准

GB/T36833-2018

马铃薯X病毒检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofPotatovirusX

2018-09-17发布2019-04-01实施

国家市场监督管理总局峪非

中国国家标准化管理委员会0(..'I(J

GB/T36833-2018

目lj昌

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国中山出入境检验检疫

局、中国检验检疫科学研究院、晰江大学、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：刘洪义、刘忠梅、车瑞丰、陈定虎、魏梅生、张星哲、李桂芬、张永江、吴建祥、

封立平、袁建江、杨立群。

I

GB/T36833-2018

C.2.2RT-PCR反应

C.2.2.1引物序列

表C.1RT-PCR检测的引物序列

引物名称可｜物序列

PVX-RT-F

5’－GCTG八八CGGTTAAGTTTCCATTGAT八C-3'

PVXRTR51CGTAGTTATGGTGGTGGGAGAGTG-3'

C.2.2.2反转录合成cDNA

反转录体系见表C.2。

表C.2反转录体系

试剂l名称加lJ佯休积／µL

RNA2

20,umol/LPVX-RT-Rl

在70℃满育5min，然后立即置于冰上；放置5min

4

5×反转录反应缓冲液

10mmol/LdNTPsl

40U/µLRNA酶抑制齐I0.5

200U/µLM-MLV反转录酶l

DEPC-H,O补足至20

反应参数：42℃，45min;95℃，10min。合成的cDNA置于一20℃保存备用。也可采用RT-PCR

一步法试剂盒，操作步骤按使用说明进行。

C.2.2.3PCR反应

PCR反应体系见表C.30反应参数：95°C4min;95℃30日，58℃30日，72°C50s,35个循环；

72℃5mino

表C.3PCR反应体系

试剂名称1111样体积／µL

JO×PCR反应缓冲浪2.5

25mmol/LMgCl2C反应缓冲液中已含有的可不力II人）2.5

lOmmot/LdNTPsl

20µmol/LPVX-RT-Fl

20,umol/LPVX-RT-Rl

5U/µLT<1qDNA聚合酶0.2

9

GB/T36833-2018

表C.3（续）

试剂名称;JU样体积／µL

2

cDNA模板

25

ddH20补足至

C.2.3琼脂糖；疑胶电泳检测

将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入水平电泳槽，取5µL扩增反应物加1µL的6×澳酣蓝上

样缓冲液？昆匀，以及5,uLDNAMarker作为分子量标准物分别点入样孔内。电泳缓冲液1×TAE适

量，100V，电泳30min。电泳结束后，放入0.5µg/mL澳化乙键（或其替代物）溶液中染色10min，将整

个凝胶置于凝胶成像系统上拍照，记录结果。

C.3结果判断

C.3.1阳性对照在753bp左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照元特异性扩增，待测样品出现与阳

性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。

C.3.2阳性对照在753bp左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照元特异性扩增，待测样品在753bp

左右处无扩增条带，判定结果为阴性。

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附录D

（规范性附录）

Real-timeRT-PCR检测

D.1Real-timeRT-PCR试剂

一步法RT-PCR反应缓冲液（TaqManOne-stepRT-PCRMixture）。

D.2实验步骤

D.2.1总RNA提取

总RNA提取同C.2.1。

D.2.2引物合成

引物序列见表D.L

表D.1Real-timeRT-PCR检测的引物序列

序列（5’－3’）

可｜物名称

PVXTmF5’-i\GGCTi\TCTGGAAGGACi\TGAi\-3'

PVXTmR5’-TGAGCAGATG八GCCCJ\CAT-3’

PVX探针5'-Fi\M-CCCACJ\GACACTi\TGGC八CAGGCTG-Tamra-3'

D.2.3Real-timeRT-PCR反应

反应体系：0.2mL离心管中力[I入2×一步法RT-PCR缓冲液山（OneStepRT-PCRBufferIll)

10µL,E.TT的IHS(5U/µL)0.4µL,PrimeScriptRT酶混合液ll(PrimeScriptRTEnzymeMixII)

0.4µL,PVX-Tm-F(lOµmol/L)0.4µL,PVX-Tm-R(10/,!mol/L)0.4µL,PVX－探针（10/,!ffiOI/L)

0.6J,!L,ROX参比染料II(ROXReferenceDyeII)0.4J,!L，模板RNA2/,!L，补DEPC-H20至20µL。

设置阳性对照、阴性对照及空白对照。

反应程序：42℃10min;95·c10s;95℃5日，60℃34日，45个循环。

PCR反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当调整，也可采用商业化试剂盒。

D.3结果判定

D.3.1基线的设置

Real-timeRT-PCR反应结束并分析结果后，应设置无效基线范围。基线范围选择在3个～15个

循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。

D.3.2检测结果的判定

在阳性对照、阴性对照和空白对照正确的前提下：

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GB/T36833-2018

一一检测样品的Ct值小于35，且出现特定的扩增曲线，判定结果为阳性。Ct值介于35～40时为

疑似阳性，需要重新进行测试，或采用其他方法进行验证。

检测样品的Ct值大于40，或未出现特定的扩增曲线，判定结果为阴性。

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附录E

（规范性附录）

RT-LAMP检测

E.1试剂

一步法RT-LAMP反应试剂盒，LAMP荧光目视检测试剂盒，纳米磁珠法提纯RNA试剂盒。

E.2实验步骤

E.2.1采用纳米磁珠试剂盒推荐的方法提取总RNA

E.2.1.1制样

取0.5g的带毒植物组织力I]入1mL抽提缓冲液进行研磨，以无病毒感染的植物作为阴性对照。

E.2.1.2清洗纳米磁珠

取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH20反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH20。

E.2.1.3结合

加入100/..tL的样品到PCR管中，用移掖枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附。

E.2.1.4清洗

在磁铁的作用下移去上清液，纳米磁珠清洗3次。

E.2.1.5裂解

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