GB/T 36844-2018 十字花科细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法

ICS65.020.01

B16

国

中华人民共和国国家标准

GB/T36844-2018

十字花科细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofPseudomonαssyringaepv.maculicolα

(McCulloch)Youngetal.

2018-09-17发布2019-04-01实施

国家市场监督管理总局峪非

中国国家标准化管理委员会0(..'I(J

GB/T36844-2018

目u昌

本标准按照GB1.1-2009给出的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准向全同植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提归井归IIo

本标准主要起草单位：中华人民共和同湖南出入境检验检疫局、中华人民共和同上海出入境检验检

疫局。

本标准主要起草人：唐连飞、周慧平、莫瑾、易建平、朱金｜司、黄迎波、谭建锡。

I

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采用商品化DNA提取试剂盒时，按试剂盒操作说明进行。

C.4PCR检测

C.4.1PCR反应体系

检测lj十字花科细菌性黑斑病菌采用的PCR反应体系见表C.2。

表C.2检测十字花科细菌性黑斑病菌的PCR反应体系

组成力II样体积／µL

2×PCR预混液10.0

正｜句号｜物（lOpmol/µL)1.0

反JoJ习｜物。Opmol/µL)1.0

模极DN八Clng/µL~10ng/µL)5

3.0

双蒸7j(

20

总体积

C.4.2PCR反应循环参数

94℃预变性3min;94℃：30日，63℃：30s,72℃：30日，进行35个循环；72℃延伸5min;4℃保存。

C.4.3PCR扩增产物的检测

用TAE电泳缓冲液制备2%的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR产物，将泪有上样

缓冲液的PCR扩增产物力11至样品孔中，用DNAMarker做分子量的标记，进行电泳分析，电泳结束后，

在凝胶成像分析仪下观察是再扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍摄并记录实验结果。

C.5实时荧光PCR检测

C.5.1反应体系

实时荧光定性PCR反应体系见表C.3。每个样品进行实时荧光定性PCR检;yllj时应设置2个平行。

表C.3实时荧光定性PCR反应体系

组成力II样体积／µL

10.0

2×PCR预混液

正JoJ习｜物（lOpmol/µL)1.0

反JoJ习｜物。Opmol/µL)1.0

探针ClOpmol/µL)1.0

模板DN八Clng/µL~10ng/µL)5

双蒸7)(2.0

20

总体积

9

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C.5.2反应条件

实时荧光定性PCR反应循环参数见表C.4。使用不同荧光PCR仪，可对参数作适当调整。

表C.4实时荧光定性PCR反应循环参数

作用时间／si!ll.皮／℃

活化DN八合成酶和预交性60096

PCRC40个循环）

1596

变性

延伸6060

设置荧光PCR反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪

器使用说明书。

C.5.3结果判断

待测样品荧光PCR检测结果两个平行样Ct注40时，同时各组实验对照结果正常，可判断检测结果

为阴性。

待测样品荧光PCR检测结果至少1个平行样35<Ct<40井陆现典型的扩增曲线，同时各组实骄

对照结果正常，此时应适当增加DNA模板量后重做实时荧光PCR检测。再次检测结果仍然Ct<40

并州政！典型的扩增件的线，同时各组实验对照结果正常，可以判断检测结果为阳性；再次检测结果

Ct二三40，同时各种实验对照结果正常，可判断检测结果为阴性。

待测样品2个平行样PCR检测结果Ctζ35并·H－＇，现典型的扩增rtn线，同时各组实验对照结果正常，

可判断检测结果为阳性。

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附录D

（资料性附录）

十字花科细菌性黑斑病菌的致病性实验例图

罔D.l示刷了十字花科细菌性黑斑病菌在油菜、花椰茎和番茄上的接种症状。

E

说明：

八、E、I一一空向对照；

B、F,J－一标准菌株ATCC51320接种油菜，花椰菜和番茄后症状；

C、G、K→一分离菌株5309-1按非1，汕菜，花椰菜和番茄后症状；

D、日、L→一分离菌株2305l按非1，油菜，花椰菜和番茄后症状。

图D.1油菜、花椰菜和番茄上的接种症状

GB/T36844-2018

参考文献

[1]任欣正．植物病原细菌的分类和鉴定［M］.北京：中国农业出版材，1994.

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PlantPathogenicPseudomonads[J].JournalofAppliedMicrobiology,1966,29(3):470-489.

[3]B.A.Latorre,A.L.Jones.Pseudomonasmorsprunorum,theCauseofBacterialCanke