GB/T 36851-2018 辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法

ICS65.020.01

B16

中华人民共和国国家标准

GB/T36851-2018

辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofXanthomonasvesicatoria

2018-09-17发布2019-04-01实施

国家市场监督管理总局申＋

中国国家标准化管理委员会oc..-i,,

GB/T36851-2018

刚吕

本标准按照GB/T1.1-2009给Iii的规则起草。

请注崽本文件的某楼内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些些专利的责任。

本标准向全罔植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提111并归口．

本标准起草单位：中罔检验检疫科学研究院、中华人民共和｜罔绥芬问：II入境检验检疫局、中华人民

共和｜国甘肃Ill入境检验检疫局、中国农科院生物技术研究所、中华人民共和国山东IfI入境检验检疫局。

本标准主要起草人：田茜、张箭、尤波、玉溪桥、赵立；军、李为民、历艳。

I

GB/T36851-2018

辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法

范围

在标准规定了章中、椒细菌性斑点病菌的样品制备、分离培养及分子牛．物学等检测方法。

本标准适用于可能携情辣椒细菌性斑点病菌的辣椒植株及种子等样品的检疫鉴定。

2碟椒细菌性斑点病菌基本信息

中文名：辣椒细菌性斑点病菌

学名：Xα，1l/io111υ，la占vesical01

异名：Xw川ο11/U阳scαIllρeslrispv.·uesicatο，·iu(Doidge)Dye.Barte川ume.L"it.ios川nGardner&.

Kendrick1921.Bucleriumvesicιtl<lriaDoidge1920,BacterittllluesicuwriwnDoidge1920.Pliytomu11ax

exiliosa(Gardner&.Kendrick)Bergeyetal.1923,PJ’”。I/IOI/αsvesicatoria(D.)Stevens1925,Phylo-

川01wsvesiclltoria(Doidge)Bergeyetal1930,Pll川OJJ/011αsexilimum(G.&.K.)Bergeyetal.1923,

Pse11dcmt011a.~l!:EiliosaGardner&.Kendrick1921.Pseudomuuasl!Iiliurn111(G.&.K.)1921,

Pseudomοna~·gurdneriSutic1957,Pseudυ11w11a~{{ardueriv缸.caρsiciSutic1957,Ps.,udumuuas·uesi-

rnluria(Doidge)Stevens1925,Xα11lfinmr111asaxο110ρoc/i$pv.v町irnloria,~α，111.homonasα：rmmpndi.~pv.

U川h"aloriCJ(Doidge)Vauterinetal.,1995,..Ya11lh1J111n11αF~r.1esicaloriα（D.)Dowson

英文名：Bacterialleafspotofpepper

分类地位：细菌界（Bacteria），变形菌(J(Proteohacteria），沪变形菌纲（Gammaproteobacteria），蛮’

单胞菌目（Xanthomonodales），黄单胞菌科（Xanthomonodacea的，黄单胞菌属（Xc111thomona.1·）。

传播途径：辣椒细菌性斑点病菌主要通过带菌种子进行远距离传播，亦随受侵染的植物残体及茎抨

等传播。在温室，带菌种子是唯一亟耍的初侵染源，但幼苗移栽也是重要的传播途径．近距离传播主要

借向雨水飞溅或喷洒瘤溉传播．

辣椒细菌性斑点病菌的其他信息参见附录A。

3方法原理

根据辣椒细菌性斑点病在寄主植物上的症状进行初步判定；根据辣椒细菌性斑点病菌的特异性

DNA序列进行分子’t物学检测；根据辣椒细菌性斑点病菌的培养性状、唯物学特性、寄主范罔及危害症

状等对病原菌进行分离培养及致病性测定．

4仪器设备和主要试荆

4.1仪器设备及用具

PCR仪、实时荧光PCR仪、超净丁．作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、制冰机、高速冷冻离心机，台式

小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡揣、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统等。

4.2主要试剂

除另有规定外，所布试剂均为分析纯．选择性培养莓配制方法见附录B；分子传物学检测所需试开lj

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见附录C和｜附录D.

5栓在鉴定方法

5.1症状检查

参照附录A中的症状捕，虽点检查植株的l叶片及果实等部位是有具有辣椒细菌性斑点病的疑似症

状。病害的典型症状是：番茄果实表面产't软木葱状斑点或疮掘，边缘水涌状．卵形或不规则，辣椒果实

上很少产生症状，但早期感染可引起落果；番茄和l辣椒l叶片上，病痕111现不规则水愤状，初为绿色，后逐

渐变成褐色并坏死，详见附录A病害症状描述。注忘与番茄叶斑病菌（Ps俨ud仰Iο阳ssyr

nalo）引起邸j症状｜丘别，后者引起的斑点圳显小，并且病斑后期有用l显的黄色晕阁。

对111现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录，并采集表现症状的植株送实验室证行检削鉴定，

因间元症状植株可随机采样。

5.2样品制备

5.2.1植株样品

对于有症状样品，低情显微镜下观察病健交界处组织有元溢菌现象，若有滋菌现象，选取新鲜细织

(!JI·片或果实〉上的病假交界处〈刑T元症状样品，随机选取植物组织〉，在75%乙醇或含有效氯1%的次

氯酸俐辩液中表面消毒50s~60s，无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养皿中．加5滴～10滴无菌

水，用灭菌慑子或剪刀将病组织捣碎，静琶5min~10min，即制成组织悬浮液，用于分离培养及分子乍

物学检测。

5.2.2种子样晶

对于种子样品，取2000控种子〈蓝点挑取畸形、不成熟的种子〉倒入无菌的二．角瓶或其他容器内，

加入适量0.05mol/L磷酸吐温缓冲液，使种子完全浸投，轻轻摇晃20s~30s棍匀．在4℃下浸泡过

夜。将浸泡液1000r/min离心lm血，去沉淀．上清破10000r/min离心10rnin，弃上滑液．取沉淀，用

无菌7J<悬？？·．制成ImL~2mL样品悬浮蔽，用于分离站养及分子吧物学检测．

5.3分子生物学检测

5.3.1模板制备

对于植株或种子样品，按照5.Z的方法制备成样品悬浮液后．直接用商业化植物基因组DNA提取

试剂盒，按照操作说明l提取样品总DNA，一20℃保存备用。

对于分离培养得到的疑似菌株，可直接或经裂解处理后（97℃沸水泊10min;12000r/rr.四离心

10m山，取上清辙，一20℃保存〉作为分子生物学检测的DNA模板。

根据实验章条件，可选择下列任一方法（5.3.2或5.3.3）进行检测．

5.3.2PCR凝胶电泳检测

对于种子、植株等样品，以已知带菌的辣椒种子或植物组织作阳性对照〈若无已知情菌材料，可用模

拟带菌方式代替〉，以健康的辣椒种子或植物组织作阴性对照，以双蒸水代替模板作为有向对照，对待测

样品进行PCR凝胶电咏检测．

对于纯培养菌株．以X,'iJt'Si

照，以双蒸水代替模板作为增l气对照，对待测样品进行PCR凝胶电掠检测，具体检测步辗见附录c..

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5.3.3实时荧光PCR检测

对于种子、植株等样品及纯培养菌可进行实时荧光PCR检测，具体步骤见附录D，对照设罩间5.3.Z.

5.4分离培养鉴定

对于

rq’片和｜果实等植株样品，接照5.2.1的方法制备成组织悬河－液后，用灭菌接种环穰取悬得被在

mTMB和1CKTM培养基平板上划线分离，蓝复3次。

对于种子样品，按照5.2.2的方法制备成样品悬悴液肝，用无茵水进行10倍梯度珩释3次，各取

100µ.L稀将液在