DB21/T 3493-2021 牛体外受精胚胎生产及非手术法移植技术操作规程

ICS65.020.30

CCSB43

21

辽宁省地方标准

DB21/T3493—2021

牛体外受精胚胎生产及非手术法移植技术

操作规程

2021-08-30发布2021-09-30实施

辽宁省市场监督管理局发布

DB21/T3493—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。

起草单位：辽宁省农业发展服务中心、辽宁省牧经种牛繁育中心有限公司。

主要起草人：李宁、刘海军、刘全、黄承俊、杜学海、李傲楠、张文军、张丽君、赵刚、周成利、

唐学成、安辉。

本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，

我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。

归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862

起草单位通讯地址：辽宁省农业发展服务中心（沈阳市皇姑区辽河街60号），联系电话：024-81845035

I

DB21/T3493—2021

牛体外受精胚胎生产及非手术法移植技术操作规程

1范围

本文件规定了牛体外胚胎生产的卵母细胞采集、体外成熟、体外受精、体外培养、胚胎质量鉴定、

胚胎冷冻、胚胎解冻和胚胎移植的技术要求。

本文件适用于牛体外胚胎生产及移植的技术操作。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB4143牛冷冻精液

GB/T5458液氮生物容器

GB/T25881牛胚胎

NY/T1572牛胚胎移植技术规程

DB21/T1648牛胚胎移植技术操作规程

3术语和定义

没有需要界定的术语和定义。

4仪器与溶液

4.1仪器设备

4.1.1二氧化碳培养箱

使用前在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下平衡24h以上。

4.1.2超净台

使用前20min，打开风机和紫外线灯对操作台面和在超净台中使用的器材进行表面灭菌，液体操

作时应点燃酒精灯。

4.1.3恒温加热板，水浴锅

恒温加热板、水浴锅的使用温度为37℃，水浴锅中液体为蒸馏水。

4.1.4液氮罐

液氮含量不得低于容积的1/3。

4.2溶液

4.2.1常用溶液

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DB21/T3493—2021

抗菌生理盐水（含青霉素和链霉素各0.075g/L）、采卵液、成熟液（M199）、精子洗涤液、受精

液（BO液）、胚胎培养液（CR1aa）、胚胎冷冻液、胚胎解冻液。

4.2.2溶液配方

溶液的配方见附录A。

4.2.3溶液的制备

4.2.3.1基础溶液配制

按所配制溶液的配方称量药品，然后用超纯水逐一进行溶解。配制完成后调节pH值与渗透压，用0.22

µm孔径滤膜除菌，在无菌环境下装瓶封口备用。各类溶液应按要求存放及保存，不应使用变质或过期的

溶液。

4.2.3.2成品溶液配制

根据要求或试验设计，称量好所有药品后用基础溶液进行一次性溶解，然后用0.22µm孔径滤膜除

菌备用。不用添加任何药品的成品溶液可直接使用。

5卵母细胞的采集

5.1活体采卵

5.1.1供体牛的选择

卵巢发育良好的空怀经产母牛。

5.1.2供体牛的饲养管理

供体牛应摄入足够的优质干草、青贮或多汁饲料、精料以及清洁的饮水，保证日粮营养全面、均衡。

5.1.3采卵频率

两个月采卵一次。采卵前48h肌注FSH进行卵泡的诱导发育。

5.1.4采卵方法

于尾椎和荐椎结合处或第一与第二尾椎结合处注射2.5mL5％盐酸利多卡因进行硬膜外腔麻醉。将

带有超声波探头和采卵针（18G或21G的一次性短针头）的采卵器插入到阴道穹隆处，通过直肠把握法

将卵巢贴在探头上，在40mmHg（18G）或120mmHg（21G）负压下，根据B超屏幕上所显示的卵泡位置进

行穿刺。穿刺卵泡的表面直径为2mm～8mm。每头牛应单独采集，并标注好信息。采集后用采卵液洗管

3次，将收集的液体在37℃环境下，于4h内运回实验室。所用采卵液配方见附录A中A.1。

5.2离体采卵

5.2.1卵巢的摘取

牛屠宰后30min内摘取卵巢，置于盛37℃抗菌生理盐水的保温杯中，在4h内运回实验室。如果时

间超过4h，可在4℃低温保存环境中运回实验室。

5.2.2卵母细胞的采集

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DB21/T3493—2021

去除卵巢周围多余的组织，用37℃的抗菌生理盐水洗涤5次～6次。将洗涤好的卵巢与抗菌生理盐

水一起置于37℃的恒温加热板上备用。采卵时，用消毒的纱布包裹住卵巢，用配有18号针头的10mL

注射器从侧面穿刺，吸取表面直径2mm～8mm卵泡内的液体。可一次性将所有卵巢的卵泡液抽出，集中

捡卵；也可以每5个～6个卵巢捡卵一次。

6卵母细胞的体外成熟

6.1成熟液的预平衡

取卵前2h，制备好成熟盘与洗涤盘（1mL～2mL成熟液/次），于二氧化碳培养箱中预平衡，成熟

液配方见附录A中A.2。

6.2卵母细胞的挑选

在室温下，选择形态正常、胞质均匀、周围带有致密卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体，在成熟液中

洗涤3次～5次，备用。

6.3卵母细胞的培养

在室温下，将洗涤好的卵丘卵母细胞复合体置于预平衡的成熟液中，密度为1枚/2.5µL或50枚/mL～

100枚/mL，在二氧化碳培养箱中培养20h～24h。

7卵母细胞的体外受精

7.1受精用液的预平衡

体外受精前2h，制备好受精微滴（50µL/滴，石蜡油覆盖）、精子洗涤液(6mL)、受精液（8mL）、

卵子洗涤盘（1mL～2mL受精液/次），于二氧化碳培养箱中预平衡。精子洗涤液配方见附录A中A.3

7.2精子的体外获能

冷冻精液质量应符合GB4143的规定。将细管冻精在37℃水中解冻10s，检查活力与密度后，把精

液置于精子洗涤液中，以45°倾斜方式在二氧化碳培养箱中孵浴1h。

7.3卵母细胞的处理

将体外培养20h～24h的卵母细胞在受精液中洗涤3次～5次，洗涤过程中用100µL的移液枪微量去

除卵丘细胞，然后移入受精微滴中，10枚/滴～20枚/滴。

7.4精液的制备

孵浴后的精子取上1/3～2/3液体，在2000r/min下离心7min，弃去上清液，再用受精液洗涤一次，

然后用受精液调试密度为1×106～6×106个/mL，置于二氧化碳培养箱中备用。

7.5体外受精

将制备好的精液用100µL移液枪移入含有卵母细胞的微滴中（50µL/滴），于二氧化碳培养箱中培

养6h～8h。

8受精卵体外培养

3

DB21/T3493—2021

8.1培养液的预平衡

培养前2h，制备好培养微滴（100µL/滴，石蜡油覆盖）和洗涤盘（1mL～2mL培养液/次）于二

氧化碳培养箱中预平衡。胚胎培养液配方见附录A中A.5。

8.2体外培养

将体外受精6h～8h后的假设合子置于培养液中洗涤3次～5次，洗涤过程中用100µL移液枪或吸卵

管吹打假设合子，去除周围残留的卵丘细胞和精子。将洗涤后的假设合子移入培养微滴中，10枚/滴，

置于二氧化碳培养箱中继续培养6天～8天，中途可换液一次，也可不换，发育到桑囊胚阶段的胚胎，经

质量鉴定合格后，可进行鲜胚移植或冷冻保存。

9胚胎质量鉴定

9.1胚胎发育阶段

胚胎发育阶段划分应符合GB/T25881中的规定。

9.2可用胚胎的判定

可用胚胎的判定应按照DB21/T1648中的要求。

9.3胚胎等级评定

胚胎的等级评定应按照GB/T25881中的规定。胚胎质量分为A、B、C、D四个等级，其中A、B、C级

为可用胚胎，A、B级可用冷冻，C级只能鲜胚移植。

10胚胎冷冻与贮存

10.1胚胎冷冻保存所需溶液

胚胎冷冻保存所需溶液如下：

a)保存液：含有0.4%牛血清白蛋白的PBS液

b)1.5moL/L乙二醇冷冻液（含0.1moL/L蔗糖）：用保存液配制

c)10%甘油冷冻液：用保存液配制

10.2胚胎洗涤

洗涤的胚胎应按照DB21/T1648中的规定。

10.3胚胎平衡

胚胎的平衡应遵守DB21/T1648中的规定。

10.4胚胎装管

将平衡后的胚胎装入0.25mL细管，装管顺序：冷冻液→气泡→冷冻液加胚胎→气泡→冷冻液。胚

胎装管的示意图见图1。

4

DB21/T3493—2021

标引序号说明：

1——棉塞；2——冷冻液；3——气泡；4——冷冻液+胚胎；5——气泡；6——冷冻液；7——封口处；8——标签

塞。

图1胚胎装管图

10.5胚胎标记

在标签塞上或标签纸上依次标记生产单位、品种、供体牛号、公牛号、发育期、数量、质量和生产

日期等，乙二醇冷冻的胚胎应标记直接移植“DT”符号。如1枚A级桑椹胚表示为1M1