DB34/T 3307-2018 分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的检测 PCR法

ICS65.020.99

B21

DB34

安徽省地方标准

DB34/T3307—2018

分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2

的检测PCR法

Protocolformolecularmarkerassisted-selectionofriceblastresistancegenePi1and

Pi2PCRmethod

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2018-12-29发布2019-01-29实施

安徽省市场监督管理局发布

DB34/T3307—2018

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由安徽省种子质量监督检验站提出。

本标准由安徽省动植物检验检疫标准化委员会归口。

本标准起草单位：安徽省种子质量监督检验站、合肥丰乐种业股份有限公司、安徽省种子管理总站、

安徽出入境检验检疫局技术中心。

本标准主要起草人：周桂林、胡晓玲、吴晓亮、张文晓、周锐、周贤达、曹玉洁、范家萌、徐丽媛、

周红英、王凤杰、胡娜、宗凯、张奇、王兆贤、刘根、熊成国、王浩波。

I

DB34/T3307—2018

分子标记辅助选择抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的检测PCR法

1范围

本标准规定了分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pi1和Pi2的PCR检测方法。

本标准适用于抗稻瘟病分子标记辅助育种，以及水稻品种中稻瘟病抗源基因的分子鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

bp：basepair，碱基对

CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵

DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸

dNTPs：deoxyribonucleosidetriphosphates，脱氧核苷三磷酸

PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应

SSR：simplesequencerepeat，简单序列重复

Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐热DNA聚合酶

ddH2O：双蒸水（超纯水）

4原理

根据水稻抗稻瘟病基因Pi1、Pi2在染色体上的位置和保守区序列，分别筛选两套特异性检测引物，

包括适用于抗稻瘟病分子标记辅助育种和水稻品种中稻瘟病抗源基因初步鉴定的、与抗稻瘟病基因Pi1

和Pi2紧密连锁的分子标记，以及适用于对连锁标记检测结果进行验证和水稻品种中稻瘟病抗源基因

精确鉴定的、位于抗稻瘟病基因Pi1和Pi2序列内的特异性检测标记。提取不同水稻品种或育种群体

的DNA，利用筛选的特异性检测引物对样品DNA进行PCR扩增，依据是否扩增获得预期大小的DNA

片段来判断样品是否携带该抗稻瘟病基因及其等位基因型。

5仪器设备

1

DB34/T3307—2018

高压灭菌锅、超纯水仪、高速离心机、恒温水浴锅（30℃～100℃）、核酸蛋白测定仪、组织研磨

仪、PCR扩增仪、高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、微量可调加样器（2μL、10μL、100μL、1000

μL）。

6试剂和溶液配制

所用试剂均为分析纯，试剂配制的用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求。

6.1试剂

6.1.1DNA提取试剂

十六烷基三甲基溴化铵、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、盐

酸、氢氧化钠、氯化钠。

6.1.2PCR扩增试剂

2+

引物、DNA、dNTPs、Taq酶、10×Buffer缓冲液、ddH2O、和Mg或者Mix反应混合液。

6.1.3PAGE电泳试剂

去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青FF、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸、尿素、亲和硅烷、剥

离硅烷、DNA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛、氢氧化钠。

6.2溶液配制

见附录A。

7实验步骤

7.1DNA提取

7.1.1CTAB法

取待检样品的去壳种子、幼苗或叶片约200～300mg置于2.0mL离心管，充分研磨；每管加入

700µL经65℃预热的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴30min，期间多次颠倒混匀；每管加入等

体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合液，充分混合后静置10min；10000g离心10min，吸取上清液300

µL转移至一新管，加入600µL预冷95％乙醇，颠倒混匀，-20℃冷冻30min；10000g离心10min，

弃上清液，用70％乙醇溶液洗涤2遍；室温自然晾干后，加入超纯水或TE缓冲液400µL，充分溶

解；检测浓度后备用。

7.1.2碱煮法

将种子发芽至幼苗长度达到3cm左右时剪取0.5cm长的幼苗，或将田间植株的叶片剪取0.5

cm×0.5cm大小，放入96孔深孔板中。每孔加入40μL氢氧化钠提取液，沸水加热1min，然后加

入60μLTE缓冲液，沸水加热2min。放在4℃冰箱备用。

7.2PCR扩增

7.2.1筛选引物

2