DB46/T 280-2014 罗非鱼链球菌病检测技术规程

ICS65.150

B50

DB46

海南省地方标准

DB46/T280—2014

罗非鱼链球菌病检测技术规程

ThedetectiontechnicalregulationsforStreptococcosisinTilapia

2014-02-13发布2014-03-01实施

海南省质量技术监督局发布

DB46/T280—2014

前言

本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由海南省海洋与渔业厅提出并归口。

本标准起草单位：海南省海洋与渔业科学院、中国水产科学研究院珠江水产研究所。

本标准主要起草人：王德强、可小丽、刘志刚、佟延南、李芳远、卢迈新、高风英、朱华平。

I

DB46/T280—2014

罗非鱼链球菌病检测技术规程

1范围

本标准规定了罗非鱼链球菌病病原体与流行情况、检测链球菌所用试剂、染色液和培养基、仪器设

备、采样、临床诊断、实验室诊断、细菌致病性实验和结果判定等方法。

本标准适用于罗非鱼链球菌病的检测与诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的

版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂

SC/T7014水生动物检疫实验技术规范

SC/T7201.1鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术

3病原体与流行情况

3.1主要病原体

无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）、海豚链球菌（Streptococcusiniae）。

3.2流行情况

在我国南方罗非鱼养殖区，一年四季均有发生，水温30℃以上为爆发高峰期，对各种规格罗非鱼均

可造成危害。

4试剂、染色液和培养基

除非另有说明，检测中所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水。实验中所需常规试剂、染色

液和培养基均按SC/T7201.1和附录A的规定执行，其他分子生物学试验试剂按附录B的规定执行。

5仪器设备

除下列仪器设备外，其余仪器设备按SC/T7201.1的规定执行。

a)PCR扩增仪。

b)核酸电泳仪和水平电泳槽。

c)凝胶成像仪。

d)微量移液器。

6采样

1

DB46/T280—2014

病鱼样品采集按SC/T7014的规定执行。

7临床诊断

7.1活动情况

患病鱼活动缓慢，反应迟钝，食欲减退，离群独游；病情严重时，常在水面翻滚或打转。

7.2外部检查

体色发黑，眼球肿大突出，眼角膜发白浑浊，虹膜充血，严重者眼球脱落；下颌、鳃盖边缘、鳍条

基部不同程度的充血、出血，伴有肛门红肿、外突的现象；部分急性患病个体有时无上述症状。

7.3解剖检查

肝脏充血、肿大，颜色不均，呈花肝状，质地脆弱；脾充血肿大；胆囊充盈、充满蓝黑色的胆汁；

部分患病鱼体出现腹水，肠道有轻度炎症，肠腔内有少量黄色的粘液。

8实验室诊断

8.1病原菌分离

8.1.1平板划线分离

以无菌操作分别从病鱼眼、肝脏、脾脏、肾脏和脑组织中取少量组织划线接种于血琼脂平板，28℃

倒置培养24~48h。

8.1.2纯培养

用无菌接种环挑取单个菌落，接种于新的血琼脂平板上，28℃倒置培养24h。

8.2菌落形态

在血平板上培养24h后，无乳链球菌菌落圆形，直径1mm~2mm，呈乳白色、不透明，菌落表面湿

润光滑、微隆起、边缘整齐；海豚链球菌菌落圆形，直径1.5mm~3mm,呈灰白色、不透明，表面光滑、

湿润。

8.3革兰氏染色

按GB/T4789.28执行。

无乳链球菌革兰氏染色呈阳性，菌体为球形或卵形，无鞭毛，无芽孢，菌体呈单个、成对或长链状

排列。海豚链球菌革兰氏染色呈阳性，球形，单个或成对排列，少数3~4个排成短链状，无鞭毛，无芽

孢。

8.4生理生化检验

8.4.1常规检测方法

运动性试验

2

DB46/T280—2014

用灭菌牙签或接种针将纯培养的细菌穿刺垂直接种于半固体BHI培养基中央，28℃培养24h。通过

细菌由中央向周边迁移形成游动圈大小来检测其运动性强弱。

再用0.85%生理盐水将细菌制成轻度混浊的菌悬液（约1×106CFU/mL)，滴于载玻片上，盖上盖玻

片，显微镜观察其运动情况。

生长试验

将细菌接种于血平板，于10℃和45℃培养过夜，观察其是否生长；再将细菌分别接种于6.5%

NaCl、pH9.6的BHI液体培养基和添加0.1%美蓝牛奶BHI液体培养基中，37℃孵育48h，观察其生长情

况。

溶血试验

用无菌接种环将细菌接种于新鲜的的血琼脂平板上，28℃倒置培养24h。在血平板上形成明

显的透明环为β溶血，形成狭窄的灰绿色溶血环为α溶血，不形成溶血环为γ溶血。

马尿酸钠水解试验

用无菌接种环将待检菌接种于1mL含1%马尿酸钠的BHI液体培养基中，37℃孵育48h，1500g离

心3min，取上清液0.8mL，加入三氯化铁试剂0.2mL，立即混匀，10min~15min后观察结果；出现恒

定沉淀物为阳性。

接触酶试验

按SC/T7014规定执行。

淀粉水解试验

按SC/T7014规定执行。

吲哚试验

按SC/T7014规定执行。

V-P试验

按SC/T7014规定执行。

糖类分解试验

按SC/T7014规定执行。

0试剂盒检测方法

0.1API20STREP检测

0.1.1革兰氏染色

按GB/T4789.28执行。

0.1.2接触酶试验

按的规定执行。

3