DB37/T 4030-2020 苹果品种鉴定方法 微卫星方法

ICS07.080

B30/39

DB37

山东省地方标准

DB37/T4030—2020

苹果品种鉴定方法微卫星方法

Moleculeidentificationmethodforapplestrain

2020-07-09发布2020-08-09实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T4030—2020

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由青岛海关提出、归口并组织实施。

本标准起草单位：青岛海关技术中心、临沂大学、中国农业科学院果树研究所、中国科学院海洋研

究所。

本标准主要起草人：高宏伟、刘云国、陈新疆、王强、王鸿霞、陈盛盛、孙雯娴、孙敏、魏晓棠。

本标准系首次发布。

I

DB37/T4030—2020

苹果品种鉴定方法微卫星方法

1范围

本标准规定了苹果品种的分子鉴定方法。

本标准适用于由苹果的种苗、砧木、枝叶、果实等组织鉴定苹果品种。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则

NY/T2424—2013植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南苹果

3术语和缩略语

3.1术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1.1

品种cultivar

在一定的生态和经济条件下，经自然或人工选择形成的动、植物群体。在植物学里，品种是在植物

界的22个分类等级之下，具有相对的遗传稳定性和生物学及经济学上的一致性，并可以用普通的繁殖方

法保持其恒久性。

3.1.2

PCR多聚酶链式反应polymerasechainreaction

以拟扩增的DNA分子为模板，以末端互补的寡核苷酸片段为引物（primer），在耐热DNA聚合酶的作

用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA分子合成。重复这一过程，即可使目的

DNA片段得以大量扩增。是常规分子生物学技术之一，用于扩增特定的DNA片段。

3.1.3

基因座位（或位点）geneticlocus

基因在染色体上占有的特定位置叫基因位点。

3.1.4

微卫星序列microsatellite

又称为短串联重复序列(shorttandemrepeats,STRs)或简单重复序列（simplesequencerepeats），

是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位

1

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的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。微卫星位点通常通

过PCR扩增，扩增产物通过电泳分析并根据大小分离等位基因进行检测。

3.1.5

等位基因allele

指位于一对同源染色体相同位置上控制同一性状不同形态的基因。

3.2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

bp：碱基对（basepair）

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（HexadecyltrimethylammoniumBromide）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）

EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）

Tris：三羟甲基氨基甲烷（2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol）

4原理

不同苹果品种间SSR基因座位的等位基因存在序列长度多态性，即苹果品种间微卫星序列（SSR）依

苹果品种不同，等位变异的数量可能不同。针对特定SSR两侧序列高度保守的核酸序列，设计序列特异

性引物，利用PCR技术对重复序列进行扩增，并对PCR扩增引物进行硝酸银染色或者荧光染料标记定量区

分片段大小（bp），根据该等位变异的扩增片段大小鉴定苹果品种，在苹果品种鉴定的数据库中进行比

对，从而鉴定苹果品种。

5设备和材料

5.1设备

5.1.1天平：感量0.01g。

5.1.2均质器。

5.1.3水浴锅（0℃～100℃，感量0.1℃）。

5.1.4振荡器。

5.1.5研钵或其他粉碎装置。

5.1.6高速台式冷冻离心机。

5.1.7梯度PCR仪。

5.1.8微量可调移液器及配套吸头（50μL、100μL、200μL）。

5.1.9微量离心管（1.5mL和2mL）。

5.1.10毛细管电泳仪或者DNA分析仪。

5.2试剂

5.2.1CTAB提取缓冲液：55mmol/LCTAB，1400mmol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris，

用10%盐酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min，备用。

5.2.2CTAB沉淀液：称取1.00gCTAB，0.50gNaCl，用适量水溶解后，调节pH=8.0，定容至200mL，

高压灭菌。

2

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5.2.3RANaseRNA酶。

5.2.4TE缓冲液（pH8.0）。

5.2.5NaCl溶液，1.2mol/L。

5.2.6三氯甲烷。

5.2.7异丙醇。

5.2.870%乙醇。

5.2.9引物：根据附录A中表A.1的序列合成荧光引物，加超纯水配制成100pmol/L储存液，用于

PCR检测的工作液浓度为10pmol/L。荧光基团可以为FAM、HEX中的一种。

5.2.10毛细管电泳专用分子量内标。

5.2.11去离子甲酰胺。

5.2.12除特别说明外，所用试剂均为分析纯。水为无离子水。

5.2.13蛋白酶K。

5.2.14苯酚。

6制样

对于种苗、枝叶、果实样品，每个样品取两个平行样，各300mg。对于砧木样品取韧皮部部分，每

个样品取两个平行样，各300mg。

7检测方法

7.1样品DNA的提取

7.1.1称取300mg经的样品，液氮研磨后置于2mL离心管中，加入600μLCTAB缓冲液和40μL

蛋白酶K，振荡混匀，65℃温浴30min～90min，期间每隔10min轻柔颠倒混匀。

7.1.22000g离心5min，取上清于另一干净的2mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊

醇的混合液（25：24：1），震荡混匀。

7.1.312000g离心10min，取上清至干净的2mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀。

7.1.412000g离心10min，弃去上清液，用预热至65℃的TE缓冲液溶解DNA。

7.1.5加入5μLRNA酶溶液，37℃30min。

7.1.6加入200μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），强烈振荡。

7.1.712000g离心10min，取上清至干净的2mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀。

7.1.812000g离心10min，弃去上清液，用4℃预冷的70%乙醇500μL，涡旋清洗沉淀。

7.1.912000g离心10min，弃去上清液，倒置晾干后加100μLTE缓冲液溶解沉淀，−20℃保存

备用。也可以根据实际情况使用其他经过验证的试剂盒。

7.2DNA浓度与纯度测定

采用紫外分光光度计法测定DNA浓度和纯度。紫外分光光度计检测的最佳范围是2pg/mL～50pg/mL，

OD值应该在0.05～1的区间内。将DNA液做适当的稀释，放入紫外分光光度计的龀色皿中，于260m处测

定其吸收峰，1OD260nm=50g/mL双链DNA或38，μg/mL单链DNA。PCR级DNA溶液的OD260nm/OD280nm比值为1.7～

2.0。

7.3PCR定性检测

3

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7.3.1PCR反应引物序列表

针对种常见苹果品种鉴定用的PCR扩增引物，见附录A中表A.1。15对引物分别进行PCR的扩增。

7.3.2PCR反应参数

PCR扩增用引物序列信息见附录A中表A.1。

7.3.3PCR反应体系

PCR反应体系见附录A中表A.2。

7.3.4质控措施

检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知品种的苹果做阳性对照，用已知不含苹

果成分的模板作阴性对照，用等体积的水代替模板DNA作空白对照。

7.4毛细管电泳荧光检测

7.4.1样品上机

按照毛细管电泳仪器使用要求更换缓冲液、灌胶和在程序中输入样品信息。将FAM荧光标记的PCR

产物用超纯水稀释30倍，将HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释15倍，将TAMRA荧光标记的PCR产物用超

纯水稀释10倍，将ROX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释5倍，混合均匀。从稀释液中取1μL上样到毛细

管电泳仪专用分析板的孔中。同时加入0.1μL分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上

95℃变性5min，迅速取出置于冰上，冷却10min。离心把管内液体甩至管底后上毛细管电泳的仪器。

启动运行程序，毛细管电泳仪自动收集点用数据。

7.4.2等位数据采集

由毛细管电泳的分析软件，通过与标准分子量比对，读出每个扩增位点的样品等位基因扩增条带数

目和条带大小的数据。若采集的等位基因扩增的数据为2个扩增条带，则该样品为二倍体苹果。若采集

的等位基因扩增的数据为3个扩增条带，则该样品为三倍体苹果。若有4个扩增条带，则该样品为四倍体

苹果。二倍体纯合位点的等位基因条带的大小数据记录为X/X，杂合位点等位变异大小数据记录为X/Y。

其中X、Y分别为该位点上两个不同的等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后，无效等位变异的大

小记录为0/0。三倍体和四倍条带大小记录方式类推。

7.5结果判定及表述

7.5.1将获得样品的等位基因变异数据与附录A.3数据库中品种比较：

a)若为二倍体，品种相似度（S）按照下面的公式计算：

....................................(1)

式中：

S——相似度，单位为百分率（%）；

Nij——品种i和j之间共有的等位基因数目；

Ni——品种i中出现的等位基因数目；

Nj——品种i中出现的的等位基因数目。

b)若为三倍体，品种相似度（S）按照下面的公式计算：

4

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.....................................(2)

式中：

S——相似度，单位为百分率（%）；

Nij——品种i和j之间共有的等位基因数目；

Ni——品种i中出现的等位基因数目；

Nj——品种i中出现的的等位基因数目。

推荐使用本标准附录B配用的《苹果品种鉴定系统》软件，该软件预装了附录A.3的标准样品数据库，

并且按照以上公示设计计算程序，输入待测样品的微卫星数据，运行程序可以直接得到品种相似度最高

的相似品种信息。该软件需要在Java运行条件下安装使用。

7.5.2结果判定及表述

判定方法如下：

a)品种间相似度≤90%，判定为不同品种；

b)品种间相似度90%＜S＜100%时，判定为近似品种；

c)品种间相似度=100%，判定为疑似品种。

对于b）和c）的情况，按照GB/T19557.1和NY/T2424—2013的规定进行田间鉴定。

5

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AA

附录A

（规范性附录）

PCR扩增用引物序列信息及参考数据库

PCR扩增用引物序列信息见表A.1。

表A.1PCR扩增用引物序列信息

序引物扩增大小

名称序列（5’-3’）5’端标记荧光基团扩增条件文献来源

号方向bp

1CH01d08Fctccgccgctataacacttc

238-290

Ractctggagggtatgtcaaag

2CH01e01Fggttggagggaccaatcatt

106-120

Rcccactctctgtgccagatc

1、GeraldS.Dangl

3CH02b03bFataaggatacaaaaaccctacacag

77-109JudyYangÆ

Rgacatgtttggttgaaaacttg

DeborahA.Golino

4CH02b07Fccagacaagtcatcacaacactc

180-202ThomasGradziel.A

Ratgtcgatgtcgctctgttgpracticalmethod

5CH02b10Fcaaggaaatcatcaaagattcaagforalmondcultivar

121-159

RCaagtggcttcggatagttgidentification

6CH02b12Fggcaggctttacgattatgcandparental

101-143

Rcccactaaaagttcacaggcanalysisusing

94℃2min30

7CH02d11Fagcgtccagagcaacagcsimplesequence

sec；118-148

Raacaaaagcagatccgttgcrepeatmarkers

94℃30sec，

8CH02f06Fccctcttcagacctgcatatg135-158Euphytica(2009)

52℃30sec，

Ractgtttccaagcgatcagg168:41–48.

72℃30sec，

9CH02g09Ftcagacagaagaggaactgtatttg98-1382、L.

40cycle；

RCaaacaaaccagtaccgcaaGianfranceschi,N.

72℃，10min。

10CH02h11aFcgtggcatgcctatcatttg104-132Seglias,R.archini,

RctgtttgaaccgcttcctcM.Komjanc,C.

11CH03d07Fcaaatcaatgcaaaactgtca186-226Gessler.Simple

Rggcttctggccatgattttasequencerepeats

12CH04d02Fcgtacgctgcttcttttgct118-146forthegenetic

Rctatccaccacccgtcaactanalysisofapple.

TheorApplGenet

13CH04d10Fgagggatctgtagctccgac138-204

(1998)

Rtggtgagtatctgctcgctg

96:1069-1076.

14CH05c07Ftgatgcattagggcttgtactt111-149

Rgggatgcattgctaaataggat

15CH05g03Fgctttgaatggatacaggaacc135-192

Rcctgtctcatggcattgttg

6

DB37/T4030—2020

PCR反应体系见表A.2。

表A.2PCR反应体系

试剂名称工作液浓度25μL反应体系加样体积/μL

dNTP2.5mmol/L