DB3212/T 2050-2022 鸭甲型肝炎病毒1型与3型荧光定量PCR鉴别诊断技术规范

ICS11.020

CCSB41

DB3212

泰州市地方标准

DB3212/T2050—2022

鸭甲型肝炎病毒1型与3型荧光定量PCR

鉴别诊断技术规范

2022-05-10发布2022-05-10实施

泰州市市场监督管理局发布

DB3212/T2050—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由江苏农牧科技职业学院提出。

本文件由泰州市农业农村局归口。

本文件起草单位：江苏农牧科技职业学院、国家水禽基因库（江苏）。

本文件主要起草人：吴双、吴植、朱善元、王健、孙国波、林梦舟、纪荣超、谢军、吕海玲。

I

DB3212/T2050—2022

鸭甲型肝炎病毒1型与3型荧光定量PCR鉴别诊断技术规范

1范围

本文件定了鸭甲型肝炎病毒1型与3型核酸检测的反转录-荧光定量PCR鉴别诊断的操作技术规范。

本文件适用于泰州市所属区域鸭甲型肝炎病毒1型与3型的检测、疫情监测和流行病学调查。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4仪器设备与试剂

4.1仪器设备

4.1.1组织匀浆仪。

4.1.2高速台式冷冻离心机（12000g以上）。

4.1.3可调微量移液器（200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.2μL～2μL）。

4.1.4实时荧光定量PCR扩增仪（QuantStudio3Real-timePCRSystem）。

4.1.5水浴锅（室温～100℃）。

4.1.6冰箱（4℃，控温精度1℃）。

4.1.7冰箱（-20℃，控温精度1℃）。

4.1.8超净工作台。

4.2试剂

4.2.1RNA提取试剂Trizol（分析纯）。

4.2.2氯仿（分析纯）。

4.2.3异丙醇（分析纯）。

4.2.4焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水（超纯水）：配制方法见附录A.1。

4.2.570%乙醇（分析纯）：配制方法见附录A.2。

5样品采集与处理

采集发病、濒死或病死雏鸭的肝脏、脾脏、胰腺等新鲜组织样品。与磷酸盐缓冲液（PBS，配制方

法见附录A.3）按照体积比1:10的比例制成组织匀浆液；反复冻融3次，8000r/min～10000r/min

离心10min，取上清用于RNA抽提，或置-20℃冻存备用。若需在6h以后处理的样品，应先置-20℃

条件下保存备用，需托运时应确保冷藏或冰冻状态运输。

6引物设计

1

DB3212/T2050—2022

6.1DHAV-1标准品引物

上游引物F：5'-AACACCTGTTTGGGAGGCAATG-3'，下游引物R：

5'-GGGCAGGGAGTGGAAAGAAGAGGATTGTGCTACCATTGCTGGTG-3'，用于扩增目的条带429bp大小的基因片段。

DHAV-1实时荧光定量PCR引物F：5'-CAGGCCAACTCGACCAAT-3'，R：5'-GGCTTTTTGAGACCCATA-3'，探针

为5'-FAM-CACATCAGAGGCAACTTTTGGCAGACT-BHQ1-3'。

6.2DHAV-3标准品引物

上游引物F：5'-GCACACTCTTATACAATGGACAATC-3'，下游引物R：5'-GTGTTGTGTAGGTTGGTGCAGGTAG-3'，

用于扩增目的条带274bp大小的基因片段。DHAV-3实时荧光定量PCR引物F：

5'-CCCATTTTATTCTGTTACACCTTTACG-3'，R：5'-TGTCCAAATATACAACCTGCTAAAAGTC-