DB23/T 3733-2024 红松无性系SSR鉴别技术规程

ICS65.020.01

CCSB60

DB23

黑龙江省地方标准

DB23/T3733—2024

红松无性系SSR鉴别技术规程

2024-8-30发布2024-9-29实施

发布

黑龙江省市场监督管理局

DB23/T3733—2024

前言

本文件依据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由黑龙江省林业和草原局提出。

本文件由黑龙江省林业和草原局标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：东北林业大学、佳木斯市孟家岗林场、苇河林业局青山林木种子园、宁安市渤海林

木种子园、五常市宝龙店种子林场、鹤岗市林木良种繁育中心。

本文件主要起草人：张含国、闫平玉、张磊、孙国飞、潘凤刚、李金泉、石宝英、胡振宇、曹振宇、

李志新。

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红松无性系SSR鉴别技术规程

1范围

本文件规定了红松（PinuskoraiensisSiebold&Zucc.）无性系SSR鉴别技术中技术原理、仪器设备及

试剂、溶液配制、操作程序、数据记录与统计、判定规则及档案管理等要求。

本文件适用于红松无性系的SSR指纹数据采集及品种鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件仅

该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1核心引物

快速、准确、稳定鉴定无性系的SSR引物。

3.2补充引物

核心引物检测出不同无性系差异位点数小于2时可选择的引物。

4缩略语

DNA：DeoxyriboNucleicAcid脱氧核糖核酸。

PCR：PolymeraseChainReaction聚合酶链式反应。

SSR：SimpleSequenceRepeats简单重复序列。

EDTA：EthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸。

TEMED：N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine四甲基乙二胺。

dNTP：deoxy-ribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸。

PAGE：PolyacrylamideGelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳。

CTAB：HexadecyltrimethylammoniumBromide十六烷基三甲基溴化铵。

TBE：Tris-Borate-EDTAbuffer-硼酸-乙二胺四乙酸二钠缓冲液。

5技术原理

5.1遗传差异

由于不同红松无性系遗传组成不同，基因组DNA中SSR的重复次数存在广泛差异。

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5.2检测技术

简单重复序列差异可以通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而区分不同红松无性系。

6仪器设备及试剂

6.1主要仪器设备

PCR扩增仪；电泳仪（具有恒电压、恒电流功能）；垂直电泳槽及配套的制胶附件；水平电泳槽及配

套的制胶附件；高速离心机（最大离心力大于15000g）；水平摇床；电子天平（精度为0.1mg）；微量移

液器（规格分别为2.5μL、20μL、200μL、1000μL，连续可调）；磁力搅拌器；超微量分光光度计；微波

炉；高压灭菌锅；水浴锅；超低温冰箱（最低温度-80℃）；制冰机；凝胶成像系统。

6.2主要试剂

十六烷基三乙基溴化铵；三氯甲烷；异丙醇；异戊醇；乙二胺四乙酸二钠二水合物；三羟甲基氨基甲

烷；氢氧化钠；浓盐酸；10×缓冲液（含Mg2+25mmol/L）；dNTP；DNA聚合酶；琼脂糖；DNA分子量

标准；核酸染色剂；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二苯甲青；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；硼酸；无水乙醇；

过硫酸铵；硝酸银；甲醛。

7溶液配制

7.1DNA提取溶液

0.5mol/LHCI溶液：25mL浓盐酸（36%~38%），加水定容至500mL。

TE：1mol/LTris-HCl溶液5mL，0.5mol/LEDTA溶液1mL，加0.5mol/LHCI溶液调pH至8.0，定容

至500mL。

0.5mol/LEDTA溶液：186.1g乙二胺四乙酸二钠二水合物溶于800mL水中，氢氧化钠调pH至8.0，

定容至1L，高压灭菌。

1mol/LTris-HCI溶液：60.55g三羟甲基氨基甲烷溶于适量水中，加0.5mol/LHCI溶液调pH至8.0定

容至500mL，高压灭菌。

CTAB提取液：81.7g氯化钠和20gCTAB溶于适量水中，加1mol/LTris-HCl溶液100mL，0.5mol/L

EDTA40mL，定容至1L，4℃贮存。

7.2PCR扩增溶液

SSR引物：用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均10μmol/L的工作液。

加样缓冲液（6×）：去离子甲酰胺49mL，0.5mol/L的EDTA溶液1mL，溴酚蓝0.125g，二甲苯青

0.125g。

7.3聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液

30%PAGE胶：丙烯酰胺290g，甲叉双丙烯酰胺10g，定容至1L。

7%PAGE胶：10×TBE50mL，30%PAGE胶233.3mL，定容至1L。

25%过硫酸铵溶液：0.25g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。

TBE（10×）：三羟甲基氨基甲烷108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA溶液37mL，定容至1L。

TBE（0.5×）：10×TBE50mL，加水定容至1L。

7.4银染溶液

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染色液：1g硝酸银，定容至1L。

显影液：1L蒸馏水，加入15g氢氧化钠和5mL甲醛，混匀（甲醛现用现加）。

银染溶液的配制使用符合GB/T6682中4.3规定的三级水，试验过程使用符合分析纯的试剂和GB/T

6682中4.3规定的一级水。

8操作程序

8.1样品要求

送检样品宜为一年生针叶，-80℃超低温冷冻保存。同一红松无性系样品数量应大于5个。

8.2DNA提取

使用CTAB提取法，或适合SSR指纹技术的商业试剂盒进行DNA提取。琼脂糖凝胶（1%）电泳检测

DNA质量并进行浓度测定，稀释至20ng/μL充分溶解后备用。

8.3PCR扩增

8.3.1引物选择

引物信息包括核心引物信息和补充引物信息。

选择使用核心引物进行检测，核心引物信息见附录A.1。当检测出不同无性系差异位点数小于2时，

选择使用补充引物进行检测，补充引物信息见附录A.2。

8.3.2反应体系

PCR反应采用20μL体系。

8.3.3反应程序

94℃预变性3min，1个循环；94℃变性30s，51℃~60℃退火30s，72℃延伸15s，共35个循环；

72℃延伸7min，4℃