DB35/T 1354-2013 罗非鱼无乳链球菌病双重PCR 诊断规程

ICS65.150

B52

DB35

福建省地方标准

DB35/T1354—2013

罗非鱼无乳链球菌病双重PCR诊断规程

Diagnosticprotocolsoftilapiainfectedwithstreptococcusagalactiae

byduplexpolymerasechainreaction

2013-08-01发布2013-11-01实施

福建省质量技术监督局发布

DB35/T1354—2013

前言

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。

本标准由福建省海洋与渔业厅提出并归口。

本标准负责起草单位：福建省淡水水产研究所、顺昌县水产技术推广站。

本标准主要起草人：樊海平、吴斌、张新艳、邓志武、郑磊、钟全福、曾占壮。

I

DB35/T1354—2013

罗非鱼无乳链球菌病双重PCR诊断规程

1范围

本标准规定了罗非鱼无乳链球菌病的术语和定义、流行情况与主要症状、样品采集与处理、双重PCR

检测和诊断。

本标准适用于罗非鱼无乳链球菌病的诊断、流行病学调查、检疫与监测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

SC/T7014-2006水生动物检疫实验技术规范

SC/T7103-2008水生动物产地检疫采样技术规范

SC/T7202.2-2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法

3术语和定义

下列术语与定义适用于本文件。

3.1

罗非鱼无乳链球菌病streptococcosisoftilapiainfectedbystreptococcusagalactiae

罗非鱼受无乳链球菌感染，发生病理变化，出现行为异常或死亡。

4试剂与溶液

4.1无乳链球菌16SrRNA基因部分序列引物：

——F1：5'-TTTGGTGTTTACACTAGACTG-3'，浓度10µmol/L，-20℃保存；

——R1：5'-TGTGTTAATTACTCTTATGCG-3'，浓度10µmol/L，-20℃保存。

4.2无乳链球菌sip(表面免疫相关蛋白)基因序列引物：

——F2：5'-ATGAAAATGAATAAAAAGGTACTATTG-3'，浓度10µmol/L，-20℃保存；

——R2：5'-TTATTTGTTAAATGATACGTGAACA-3'，浓度10µmol/L，-20℃保存。

4.3溶菌酶（100µg/mL）：生化试剂，-20℃保存。

4.4蛋白酶K(100µg/mL)、NaCl（3mol/L）、裂解缓冲液和SYBRGreenⅠ工作液按附录A的规定配

制。

4.5DNA分子量标准（0.1kb～1.5kb）：生化试剂，-20℃保存。

4.6阳性对照：无乳链球菌标准株的DNA模板，-20℃保存。

4.7阴性对照：已知无乳链球菌阴性的罗非鱼组织样品DNA模板，-20℃保存。

4.8空白对照：无菌双蒸水为空白模板。

1

DB35/T1354—2013

4.9除上述试剂与溶液外，其余按SC/T7202.2-2007第5章的规定执行，实验室用水符合SC/T

7014-2006中第5章的规定。

5仪器与设备

5.1PCR扩增仪:配备25µL和50µL的PCR反应底座。

5.2凝胶成像仪：可发射紫外线，携带摄影系统。

5.3电泳仪：输出直流电压0V～400V，直流电流1mA～500mA。

5.4水平电泳槽：容量250mL～650mL，带凝胶板、样孔梳。

5.5台式离心机：配置1.5mL转子，转速16000r/min以上。

5.6电动组织研磨器：转速500r/min～5000r/min。

5.7研磨棒：1.05Kg/cm2、121.3℃高压蒸气灭菌15min。

5.8离心管：容量1.5mL，1.05Kg/cm2