DB63/T 1479-2016 青海草地早熟禾SSR分子标记鉴定技术规程

ICS65.020.20

B21

备案号：49251-2016DB63

青海省地方标准

DB63/T1479—2016

青海草地早熟禾

SSR分子标记鉴定技术规程

2016-03-21发布2016-05-01实施

青海省质量技术监督局发布

DB63/T1479—2016

前言

本规程按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本规程由中国科学院西北高原生物研究所提出并归口。

本规程负责起草单位：中国科学院西北高原生物研究所。

本规程主要起草人：窦全文、赵闫闫、王海庆、汪新川、喻凤、李媛、刘瑞娟、陈志国、刘德梅。

I

DB63/T1479—2016

青海草地早熟禾SSR分子标记鉴定技术规程

1范围

本规程规定了青海草地早熟禾品种真实性和纯度SSR分子标记鉴定的设备、试剂配制、操作程序、

SSR引物以及判定原则等技术内容。

本规程适用于种子管理部门、农业科研、教学、生产、推广等单位对多年生牧草品种青海草地早熟

禾真实性及纯度的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

SSR：简单重复序列

DNA：脱氧核糖核酸

dNTPs：四种脱氧核糖核苷酸

PCR：聚合酶链式反应

4仪器、设备与试剂

仪器、设备与试剂见附录A。

5试剂配制

5.1DNA提取试剂

5.1.1乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）溶液

称取EDTA-Na2·2H2O9.306g，加去离子水35mL，剧烈搅拌，用NaOH颗粒0.80g～1.11g调pH至8.0，

定容至50mL，终浓度为0.5mol/L。

5.1.2三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）溶液

称取Tris6.060g，加超纯水40mL溶解，滴加浓HCl1.8mL～2.2mL调pH至8.0，定容至50ml，

终浓度为0.5mol/L。

5.1.3DNA提取液

1

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称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）8.0g，氯化钠32.7g，Tris-HCl盐酸溶液（0.5mol/L）10mL，

EDTA溶液（0.5mol/L）4mL，混合，再用去离子水定容至400mL。

5.1.4三氯甲烷和异戊醇混合液（24：1）

量取三氯甲烷240mL和异戊醇10mL，混匀,此溶液配制在通风橱进行。

5.1.570%乙醇

5.1.610倍DNA溶解液

Tris-HC溶液（0.5mol/L）10mL，EDTA溶液（0.5mol/L）2mL，先加入到50mL去离子水中，溶

解混合均匀，再定容至100mL，高温高压灭菌（121℃，15分钟），室温保存。

5.1.71倍DNA溶解液

取10倍DNA溶解液10mL，加入90mL去离子水，混匀。

5.2PCR扩增试剂

5.2.1dNTPs混合溶液

取浓度为100mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP储存液各25μL混合，加入去离子水900μL，

配成终浓度为2.5mmol/L工作液。-20℃条件下保存。

5.2.2引物稀释

用去离子水配制引物浓度为100μM的储存液，取10μL储存液加人90μL去离子水配成10μM工

作液。

5.3聚丙烯酰胺凝胶试剂

5.3.15倍电泳缓冲液

分别称取Tris54.0g，硼酸27.5g，放于1000mL烧杯中，加入蒸馏水800mL，充分搅拌溶解，

再加入EDTA溶液（0.5mol/L）20mL，混匀，定容至1000mL。

5.3.230%丙烯酰胺

分别称取丙烯酰胺29.0g和甲叉双丙烯酰胺1.0g，并放于100mL烧杯中，加入蒸馏水80mL，充

分搅拌，定容至100mL，用滤纸过滤，于棕色瓶中4℃保存。

5.3.310%过硫酸铵

称取过硫酸铵0.100g，并放于1.5mL离心管中。加入蒸馏水1mL，充分震荡，于4℃冰箱保存,

保存期不超过7天。

5.3.41倍电泳缓冲液

取5倍电泳缓冲液500mL，加去离子水2000mL，混匀。

5.3.5加样缓冲液

2

DB63/T1479—2016

称量EDTA0.440g，溴酚蓝0.250g，二甲苯青0.025g，置于500mL烧杯中，向烧杯中加入去离

子水20mL，加热搅拌充分溶解，加入甘油18mL后，使用NaOH调节pH值至7.0，用去离子水定容至50mL，

室温保存。

5.4染色试剂

5.4.110mg/mL溴化乙锭

称量溴化乙锭0.50g，加入到200ml容器中，加入去离子水50ml，充分搅拌完全溶解溴化乙锭，

将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。

5.4.2凝胶染色液

取10mg/mL溴化乙锭溶液10μL，加入400mL的去离子水，混匀。

6引物

SSR引物见附录B。

7操作步骤

7.1试样制备

青海草地早熟禾种子单粒发芽成苗。

7.2DNA提取

DNA提取步骤如下：

a)将DNA提取液在65℃水浴中预热；

b)剪取长度为