DB13/T 5112-2019 棉花杂交种真实性和 纯 度 检 测 技 术 规 程 SSR 分子标记法

ICS65.020.20

B21

DB13

河北省地方标准

DB13/T5112—2019

棉花杂交种真实性和纯度检测技术规程

SSR分子标记法

2019-11-28发布2019-12-28实施

河北省市场监督管理局发布

DB13/T5112—2019

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由河北省农林科学院提出。

本标准起草单位：河北省农林科学院棉花研究所。

本标准主要起草人：张建宏、田海燕、唐丽媛、张素君、崔瑞敏、张香云、刘存敬、李兴河、王

海涛。

I

DB13/T5112—2019

棉花杂交种真实性和纯度检测技术规程SSR分子标记法

1范围

本标准规定了利用简单重复序列（simplesequencerepeats，SSR）分子标记进行棉花杂交种真

实性和纯度检测的术语和定义、原理、仪器设备、试剂及溶液配制、引物、样品准备、操作步骤、真

实性检测和纯度检测。

本标准适用于基于SSR分子标记的棉花杂交种真实性和纯度检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本

文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验

GB4407.1经济作物种子纤维类

NY/T1385棉花种子快速发芽试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

品种真实性varietalgenuineness

是指本标准中供检样品在DNA分子标记带型上与标准样品的一致性（差异位点数≤2）。

3.2

品种纯度varietalpurity

供检样品中真实性种子占供检样品的百分率。

3.3

SSR分子标记simplesequencerepeats

是指由几个核苷酸（一般为2～6个）为重复单元的多达几十至几百次的串联重复，由于基本单元

重复次数的不同，进而形成SSR座位的多态性，根据SSR座位两侧保守的单拷贝序列设计一对特异引物

来扩增SSR序列，即可揭示其多态性。

3.4

核心引物coreprimer

1

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指品种DNA鉴定优先选用的一套SSR引物，具有多态性高、重复性好等综合特性，可用于品种DNA

真实性和纯度检测。

3.5

标准样品standardsample

代表已知品种特征特性的F1代种子。

4原理

SSR广泛分布于基因组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。根据SSR序列两端保

守的单拷贝序列设计特异引物，利用聚合酶链式反应（PCR）技术对重复序列进行扩增和电泳分析，获

得样品单株的SSR电泳带型。将受检样品与标准样品的带型进行差异比较和分析，通过棉花杂交种SSR

检测来判定品种的真实性和纯度。

5仪器设备、试剂及溶液配制、引物

仪器设备见附录Ⅰ，试剂及溶液配制见附录Ⅱ，引物相关信息见附录Ⅲ。

6样品准备

受检样品和标准样品均采集棉花的幼嫩叶片。标准样品纯度应符合GB4407.1的规定，种子扦样按

GB/T3543.2的规定执行，种子发芽按GB/T3543.4、NY/T1385的规定执行。

以受检样品所标注品种的标准样品作为对照，同时检测受检样品和标准样品。真实性检测需标准

样品和受检样品的种子或单株，各12粒（株），品种纯度检测需受检样品的F1种子或单株80粒（株）。

7操作步骤

DNA提取、PCR扩增、PCR产物检测具体试验操作步骤见附录IV。

8棉花杂交种真实性检测

在36对核心引物中，按照染色体随机选择26对引物进行扩增，比较受检样品和标准样品在每个位

点的异同。

8.1差异位点比较与判读

8.1.1某核心引物在受检样品和标准样品间所扩增出的条带类型完全一致，表现为无差异带型，记为

相同位点。

8.1.2某核心引物在受检样品和标准样品间扩增出的条带不完全一致，当表现异类型的单株数≤2

时，该差异带型为偶然差异带型，记为疑似相同位点。

8.1.3某核心引物在受检样品和标准样品间扩增出的条带不完全一致，当表现异类型的单株数＞2

时，该差异带型为异带型，记为差异位点。

2

DB13/T5112—2019

8.2结果判定

采用差异位点数来判断棉花杂交种的真实性。按8.1的方法分别统计受检样品和标准样品在26对核

心引物上表现出的相同位点数、疑似相同位点数和差异位点数，当差异位点数＞2时，判定为F1不真实，

混杂了其他品种或亲本；当差异位点数≤2时，判定为F1真实。

9棉花杂交种纯度检测

采用品种纯度来表示棉花杂交种的纯度。利用15对核心引物检测至少80个受检样品，统计每对核

心引物扩增时出现差异带型的样品号。每个样品电泳谱带与标准谱带不一致的位点数≤2，则判定为真

实株；电泳谱带与标准谱带不一致的位点数＞2，则判定为杂株。

3

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附录A

（规范性附录）

仪器设备

A.1一般选用以下仪器、设备：

---PCR扩增仪；

---电泳检测系统：电泳仪、电泳槽及配套的制胶附件；

---高速离心机；

---高通量组织研磨仪；

---恒温水浴锅；

---电子天平（精度1/10000）；

---单道微量移液器：10L、20L、100L、200L、1000L；

---多道微量移液器：8道或12道，10