DB14/T 1518-2017 晋汾白猪种质分子鉴定SSR标记法

ICS65.020.30

B43

DB14

山西省地方标准

DB14/T1518—2017

晋汾白猪种质分子鉴定SSR标记法

2017-12-10发布2018-02-10实施

山西省质量技术监督局发布

DB14/T1518—2017

目次

前言II

1范围1

2规范性引用文件1

3术语和定义1

4原理2

5试验准备2

6步骤2

7判定依据3

8结果表述3

附录A（规范性附录）溶液配制说明4

附录B（资料性附录）FAO-引物信息表ISAG推荐7

附录C（资料性附录）样品DNA的制备及质控检测8

附录D（资料性附录）PCR反应体系及程序10

附录E（资料性附录）扩增产物的银染检测方法11

附录F（资料性附录）数据分析指标及公式13

DB14/T1518—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由山西农业大学提出并归口。

本标准起草单位：山西农业大学、中国农业大学、大同市种猪场、山西省畜禽繁育工作站、山西天

合元动物保健科技有限公司。

本标准主要起草人：高鹏飞、郭晓红、曹果清、李步高、刘剑锋、杨连仲、王效京、刘宏、孙秉耀、

石建中、赵万军。

II

DB14/T1518—2017

晋汾白猪种质分子鉴定SSR标记法

1范围

本标准规定了利用SSR标记法进行晋汾白猪品种鉴定的原理、试验准备、步骤、判定依据和结果表

述。

本标准适用于晋汾白猪种质分子鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

NY/T1673畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程

SN/T2123出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范。

DB14/T1300晋汾白猪

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

SSR标记

SSR标记，即简单重复序列（SimpleSequenceRepeats,SSR），又称微卫星DNA，由核心序列和两

侧的侧翼序列组成，侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体上，核心序列重复数的差异形成微卫星高度

的多态性。

3.2

参照样品

对应于SSR位点不同等位基因的一组样品。

3.3

位点

对应于SSR位点不同等位基因的一组样品。

3.4

核心位点

1

DB14/T1518—2017

DNA分子标记法鉴定品种时优先选用的一组位点，具有多态性高、稳定性强、重复性好、分布均匀

等特点。

3.5

扩展位点

DNA分子标记法鉴定品种时备选的一组位点，具有重复性好，分布均匀的特点。

4原理

根据SSR侧翼序列设计一对特异引物，利用PCR技术扩增目的片段，由于不同个体SSR重复数不等，

电泳后不同长度的PCR产物得以分离，经硝酸银染色加以区分。

5试验准备

5.1实验仪器设备

凝胶成像系统、PCR仪、低温高速离心机、紫外分光光度计、稳压温流电泳仪、高压灭菌器、单道

可调移液器(2μl，10μl，20μl，100μl，200μl，1000μl)、微量电子天平、水浴恒温震荡器、电

泳槽、普通离心机、紫外检测仪、超纯水仪。

5.2试验所用试剂

血液裂解液、组织DNA提取液和精子裂解液、饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、溴化乙锭、

10×TBE或TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲液、100bpDNA分子量标记、冰乙酸、琼脂糖、RNA酶、蛋白酶K、

丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、硝酸银、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）、无水碳酸钠、

dNTPs、TapDNA聚合酶、超纯水。

5.3溶液配置

溶液配置方法见附录A，除另外说明外，附录A中仅使用确认为分析纯的试剂。

6步骤

6.1样品采集

6.1.1对于动物样品的采集与保存按照SN/T2123的规定执行。

6.1.2采集个体应具备晋汾白猪品种的典型特征，符合DB14/T1300的要求，采集三代内无血缘关系

的个体不少于30头，其中雌性数量不少于1/3。

6.1.3样品采集时应详细记录材料名称、来源、系谱、采集地点和时间、样品保存条件。

6.2样品DNA提取

样品DNA的制备方法参见附录B。

6.3引物合成

2

DB14/T1518—2017

使用联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)推荐的用于畜禽微卫星DNA遗传检测的标记

30对，引物序列参见附录C。引物合成委托生物公司合成。

6.4DNA微卫星位点的扩增及检测

6.4.1采用PCR方法扩增所选微卫星引物的目的片段。

6.4.2PCR反应体系及程序参见附录D。

6.4.3扩增产物的检测方法参见附录E。

6.5基因分型

6.5.1利用凝胶成像分析系统进行分析，根据分子量标记物的大小标定检测片段的大小。

6.5.2扩增片段要求条带清晰；纯合子为一条带，杂合子为两条带，且两条带着色深浅基本一致。

6.5.3根据片段大小确定等位基因型。

6.6数据统计分析

6.6.1数据统计分析等位基因频率、哈代-温伯格平衡、遗传杂合度、多态信息含量、基因分化系数、

Nei氏遗传距离，具体算法公式参见附录F。

6.6.2应用GENEPOP软件进行数据分析并进行聚类分析，采用Bootstrap检验可检验所得系统发生树

的可靠性。

7判定依据

7.1品种间差异位点数≧3，判定为不同品种。

7.2品种间差异位点数=2或1，判定为近似品种。

7.3品种间差异位点数=0，判定为疑同品种。

7.4对7.1和7.2的结果，结合表型检测数据进行综合判定。

8结果表述

检测位点数为，差异位点数为，判定为遗传相似度为，位点缺失率为，判定为

（相同或相近、不同）。

3

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附录A

（规范性附录）

溶液配制说明

A.1DNA提取试剂的配制

A.1.1血液裂解液

血液裂解液配制见表A.1。

表A.1血液裂解液的配制

贮存液浓度体积(mL)使用浓度

1mol/LTris-HCL（pH8.0）110mmol/L

0.5mol/LEDTA（pH8.0）20100mmol/L

10%SDS202%

灭菌双蒸水加至100—

A.1.2组织DNA提取液

组织DNA提取液配制见表A.2。

表A.2组织DNA提取液的配制

贮存液浓度体积（mL）使用浓度

1mol/LTris-HCL（pH8.0）550mmol/L

0.5mol/LEDTA（pH8.0）20100mmol/L

0.5mol/LNaCl20100mmol/L

10%SDS202%

灭菌双蒸水加至100—

A.1.3精子裂解液

精子裂解液配制见表A.3。

表A.3精子裂解液的配制

贮存液浓度体积(mL)使用浓度

1mol/LTris-HCL（pH8.0）110mmol/L

0.5mol/LEDTA（pH8.0）210mmol/L

0.5mol/LNaCl20100mmol/L

10%SDS202%

1mol/LDDT（现用现加）0.003939μmol/L

灭菌双蒸水加至100—

A.1.4精子洗涤液

4

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取1mol/LNaCl37.5mL，0.5mol/L的EDTA5mL，加双蒸水至250压灭菌备用。mL。高

A.1.50.5mol／LEDTA溶液

1.86.1gEDTA-Na22H2O溶于800ml水中，用1mol／LNaOH调PH至8.0，定容至1000mL，在103.4

kPa灭菌。

A.1.61mol／LTris-HCL溶液

60.55gTris-base溶于适量水中，加1mol／LHCL调PH至8.0，定容至500mL，103.4kPa灭菌。

A.1.70.5mol／LHCL溶液

25mL浓盐酸（36%～38%），加水定容至500mL。

A.1.8氯仿-异戊醇（24:1）

按24:1的比例（体积比）配制混合液。

A.1.9TE缓冲液

1mol／LTris-HCL5mL，0.5mol／LEDTA1mL，加HCL调pH至8.0，定容至500mL。

A.1.10蛋白酶K贮存液（20mg/mL）

200酶mg蛋白K溶于10mL灭菌双蒸水中，分装，每管1mL,-20℃冻存。

A.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制

A.2.130%丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29：1）

200溶解mL水中285g丙烯酰胺，15g甲叉双丙烯酰胺，定容至1L，4℃保存。

A.2.26%PAGE胶

尿素450g，10xBTE缓冲液100mL，40%PAGE胶150mL，定容至1000mL。

A.2.310%过硫酸铵溶液

8mL水中溶解1g过硫酸铵，加水至10mL4℃保存。

A.2.410xTBE缓冲液

Tris-base108g，硼酸55g，EDTA-Na22H2O7.44g，定容至1L。

A.2.51xTBE缓冲液

10xTBE缓冲液500mL，定容至5L。

A.2.66x加样缓冲液

去离子甲酰胺（用于DNA变形）49mL，0.5mmol／LEDTA1mL，溴酚蓝0.125g，二甲苯青0.125g。

A.3银染试剂的配制

5

DB14/T1518—2017

A.3.1固定液

200mL冰醋酸，加水定容至2000mL。

A.3.2染色液

3g硝酸银，加水定容至2000mL。

A.3.3显影液

2000mL，蒸馏水中加入25g氢氧化钠和7mL甲醛