DB22/T 2394-2015 猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的制备和鉴定

ICS65.020.30

B43

DB22

吉林省地方标准

DB22/T2394—2015

猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的

制备和鉴定

Regulationofpreparationandidentificationofinducedpluripotentstemcellsfrom

pigs

2015-12-15发布2016-01-25实施

吉林省质量技术监督局发布

DB22/T2394—2015

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由吉林省标准研究院提出。

本标准由吉林省畜牧业管理局归口。

本标准起草单位：吉林省标准研究院。

本标准主要起草人：赵慧明、张学明、李子义、唐博、崔娜娜、王琪、杨磊。

I

DB22/T2394—2015

猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的制备和鉴定

1范围

本标准规定了源于猪胎儿成纤维细胞的猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的工作区条件、主要仪器设

备、清洗与消毒、试剂及液体配制、猪iPSCs的制备、警示、标签及其他要求。

本标准适用于猪iPSCs在畜牧业生产实践、基础医学研究和临床医疗等方面的应用。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T15562.2环境保护图形标志固体废物贮存（处置）场

GB/T24863畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程

HG/T3935哺乳类动物细胞培养基

NY/T1900畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范

SN/T2330化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验

3术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

诱导多潜能干细胞inducedpluripotentstemcells(iPSCs)

通过转染特定的转录因子（如经典的胚胎特异性转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4组合），从已

分化体细胞（如成纤维细胞）重编程而获得的多潜能干细胞。

3.2

猪胎儿成纤维细胞porcinefetalfibroblast(PFF)

从妊娠25-30天猪胎儿中，去头、尾、四肢、骨骼、内脏后，消化分离获得的有良好增殖能力的细

胞。

3.3

饲养层细胞feederlayercell

将动物胎儿成纤维细胞经丝裂霉素C处理后，失去分裂增殖能力的活细胞。

3.4

拟胚体embryoidbody

釆用悬滴法培养，将干细胞或iPSCs克隆消化成单细胞，检测其体外发育分化能力的方法。

3.5

畸胎瘤teratoma

1

DB22/T2394—2015

采用皮下注射法，将干细胞或iPSCs注射到免疫缺陷鼠皮下组织中，在SPF级条件下饲养，被注射细

胞在体内形成的含三胚层组织结构的瘤体组织。

4工作区条件

4.1工作区域一般由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室、SPF实验动物饲养设施等组成，内部设

备条件按照GB/T24863和SN/T2330执行。

4.2缓冲间应不小于3m2，并设有更衣柜和紫外灯；紫外灯的强度≥1.5W/m3，紫外灯管距地面不应超

过2.5m，每次照射时间30min以上。

4.3无菌室的最低标准应达到万级，并配备通风设备。

5主要仪器、设备

超净工作台、生物安全柜、冰箱、液氮生物容器、离心机、CO2培养箱、纯水装置、高压蒸汽灭菌

器、电子天平、倒置显微镜、荧光显微镜、PCR仪、荧光定量PCR仪、-80℃超低温冰箱。

6清洗与消毒

所用玻璃器皿和金属器材的清洗与消毒按照GB/T24863执行。

7试剂及液体配制

各种使用液均用去离子水配制，充分溶解，立即用0.22μm滤膜滤过除菌，除特殊说明，均分装贮

存于-20℃下备用，并执行GB/T24863和NY/T1900。包括：水、DMEM(dulbecco'smodifiedeaglemedium)

培养基、青-链霉素、无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶-EDTA、冻存液、丝裂霉素C、LB培养基、

293细胞培养基、转染培养基、Opti-MEM、ES培养基、条件性培养液、IV型胶原酶（见附录A.1～A.14）。

8猪iPSCs的制备

8.1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备

将见栓12.5d的SPF级（无特定病原体）ICR品系孕鼠用脱颈法处死，分离、培养胎儿成纤维细胞，

原代细胞生长至约90%密度时进行传代、丝裂霉素C处理、清洗、消化、计数、冻存。（具体步骤见附录

A.15）。

8.2猪胎儿成纤维细胞制备

8.2.1取材

无菌手术取出妊娠25d～30d的猪子宫，两端扎紧后运回实验室，将子宫整个浸泡于75%的酒精中

消毒30s，将消毒后的子宫送入细胞培养室中，剪开子宫，取出羊膜完整的胎儿置于75%的酒精中浸泡

30s，取出用PBS洗3次后移入生物安全柜中。用剪刀将胎儿去除头、尾、四肢、内脏、脊椎骨及肋

骨，用PBS冲洗剩余组织，将组织剪碎至组织块直径均小于1mm。

8.2.2消化

2

DB22/T2394—2015

加入少量PBS，将组织块吸出置于50ml离心管中，加入10ml0.25%胰酶-EDTA溶液，置于37℃培养

箱中消化15min，间隔2min～3min吹打一次。消化结束后加入10ml含10%胎牛血清（FBS）的DMEM终

止消化，轻轻吹打将细胞重悬，使用200目筛网过滤，收集滤液，300g离心8min，弃净上清液。

8.2.3培养

加入10ml含10%FBS的DMEM将细胞重悬，移入2个T-75培养瓶中，每瓶再加入10ml培养液，置于

培养箱中，37.5℃、5%CO2条件培养培养，24h后换液，去除悬浮的细胞。待细胞铺满培养瓶面积的80%～

90%（2d～3d），可将细胞进行冻存或传代。

8.3诱导iPSCs质粒制备

8.3.1转化

将包含4种转录因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4，参见附录）和绿色荧光蛋白（GFP)的逆转录病

毒质粒（pMX-Oct4、pMX-Klf4、PMX-Sox2、pMX-C-myc和pMX-GFP)及辅助质粒Vsvg分别转入DH5α感受

态细菌（见附录A.16）。

8.3.2筛选

向每管细菌中加入液体LB培养基900μl，置于恒温摇