GB/T 13267-1991 水质 物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法

中华人民共和国国家标准

水质物质对淡水鱼(斑马鱼)

急性毒性测定方法GB/T13267一91

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acutetoxicityofsubstancetoafreshwaterfish

(BrachydaniorerioHamilton-Buchanan)

本标准参照采用国际标准ISO73463-3f(水质—物质对淡水鱼(斑马鱼Iirachydanio二。o)急性

致死毒性的测定)},

本标准可根据被测物质的性质确定采用静水式、换水式或流水式试验。

推荐采用斑马鱼井不排除使用其他鱼种，但对试验条件需做相应的改变,例如稀释水性质及温度。

除斑马鱼(Brachydaniorerio)外，在不改变本标准的试验条件下，青娥鱼(Oryziaslatipes)(真骨鱼

总目青娜科)亦可供使用。

本标准使用重铬酸钾(K,Cr,4,)为参考毒物。在24h试验期间重铭酸钾的LC50值必须处于20。一

400mg/L之间。

飞主题内容与适用范阻

本标准规定了在确定的试验条件下测定水溶性物质引起斑马鱼急性致死毒性大致范围的方法—

静水法、换水法和流水法口

本标准适用于水中单一化学物质的毒性测定。工业废水的毒性测定也可使用此方法。(废水样品的

采集、保存、干扰的处理见附录A,)

2原理

在确定的试验条件下用斑马鱼为试验生物测定毒物在48h或96h后引起受试斑马鱼群体中5。%

鱼致死的浓度。这个浓度以24h,48h,72h或96hLC50表示。

3定义

3,1静水式试验

试验期间不需更换试验液，限于研究那些化学性质比较稳定的物质。

32换水式试验

每24h或更短的时间内更新一次试验液。可用于试验这类物质。它们的浓度在更换试验液的时间

内相对稳定(亦即波动在初始值的20Y,之内)。

3.3流水式试验

试验液连续更新;可用于大多数物质，包括水中不稳定的物质。

Q试验生物和试验溶液的制备

4.1试验生物

国家环境保护局，991-09一14批准1992一08一01实施

GB/'r13267一91

试验鱼种应是斑马担尼鱼(真骨鱼总目，鲤科)(BrachydaniorerioHamilton-Buchanan(Teleostei

Cyprinidae)3。试验鱼体长3015mm，体重。.3士。.1g,选自同一驯养池中规格大小一致的幼鱼。试验

前该鱼群应在与试验时相同的环境条件下，在连续曝气的水中至少驯养两周。试验前24h停止喂饲，每

天清除粪便及食物残渣。驯养期间死亡率不得超过1o/0n，如果超过10%，则该批鱼不得用作试验

试验鱼应无明显的疾病和肉眼可见的畸形。试验前两周内不应对其做疾病处理。斑马鱼驯养、繁殖

的环境参数见附录B

4.2标准稀释水

新配制的标准稀释水pH为7.8士。.2，硬度为250mg/L左右(以CaCO。计)，用蒸馏水或去离子水

由下面4种溶液制备。

a.氯化钙溶液

将11.76g氯化钙(CaCl,，2H,O)溶于水中并稀释至1L.

b.硫酸镁溶液

将4.93g硫酸镁(MgSO,·7H}O)溶于水中并稀释至1L,

c.碳酸氢钠溶液

将2.59g碳酸氢钠(NaHCO,)溶于水中并稀释至1L,

d氯化钾溶液

将0.23g氯化钾(KCl)溶于水中并稀释至1L,

将以上四种溶液各取25mL加以混合并用蒸馏水稀释至1L。将制备好的稀释水曝气至溶解氧浓

度达到空气饱和值(ASV)，并将pH稳定在7.8士。2。如果需要，用氢氧化钠溶液或盐酸调节pH，这样

制备的稀释水试验前不需强制曝气。

4.3制备试验物质储备液

配制试验物质储备液所用试剂至少为分析纯。将已知量的试验物质溶于一定体积稀释水、去离子水

或蒸馏水中。储备液应当天配制。对于化学性质较稳定的物质，可配制供两天以上使用的溶液，配好后

低温保存。溶解低溶解度的物质时，可使用超声波装置，也可加入对鱼低毒的有机溶剂。有机溶剂在试

验溶液中的浓度不应超过。.1mg/L。并应同时进行两组对照试验，一组含有的溶剂为全部试验溶液中

的最高浓度，另一组则不含溶剂或试验物质。

4.4试验溶液的配制及浓度的选择

向稀释水中加人适当的试验物质储备液，使达到所需要的浓度。

配制试验溶液时，按几何级数间距选择浓度。如8,4,2,1,0.5等。在测定废水样品时，可以百分比

体积浓度按几何级数间距选择浓度。

5仪器设备

试验容器用玻璃或其他化学惰性物质制成，应不明显吸附试验物质。

常用设备、尼龙或其他软惰性材料制成的抄网，应专网专用。

5.1试验容器

静水式、换水式试验所用的容器应有足够大的容积，水量一般以鱼的负荷1克鱼/升水计算。试验介

质与空气间有足够大的界面(每IOL介质要有大约800c。的介面积).并备有牢固的密封盖。流水式试

验的容器，可用多颈的圆底玻璃烧瓶(容积2L)，带有磨口的玻璃接口(见图1)，或用类似的玻璃仪器

使用多颈圆底烧瓶时，一个颈上安有标准进口管，第二个安出口管的颈上应装一个粗孔过滤器。

初次使用的试验容器用前应仔细清洗。试验后.倒空容器，以适当的手段清洗，用水冲去痕量试验物

质及清洗剂，干燥后备用。试验容器临用前用稀释水冲洗。

cs/T13267一91

一s

图1流水法所用仪器举例

1-磨口玻璃接口沼一试验液入口;3一试验液出口;

4一磨口玻璃接口;5一粗孔过滤;6-塑料支择环

5.2控温设备

用适宜的方法将试验溶液和蓄养池中的水温调节在23士1"C,

6试验亲件

6.，采用标准稀释水为试验用水。试验溶液的配备与储存、鱼的管理及全部操作和试验都应在空气污

染物未达到有害浓度的大气中进行。

6.2为避免对试验鱼不必要的扰动，试验液中溶解氧不少于4mg/L。每天光照保持12^-16h。试验期

间水温恒定在23士10C。试验前24h停止给试验鱼喂食，整个试验期间亦不喂食。

6.3可酌情选择纯化学化合物如重铬酸钾为参考毒物。可根据需要进行多次参考毒物的毒性试验，以

得到参考毒物试验数据重现性的资料。每当蓄养种群发生变化都应按本方法规定的条件重复进行试验

这些试验结果应与同一实验室早先测得的结果一致。

试验步骤

7.1预备试验

7.1.1预备试验用于确定试验浓度的大致范围。这一范围一般可以以10为公比做间隔。例如:1000,

100,10,1和0.1mg/Lo

向六个容器中均加入标准稀释水(4.2)，如果需要，进行曝气使溶解氧浓度恢复到空气饱和值。向其

中五个容器中加入适量的试验物质储备液(4.3)，配制一组适宜的浓度系列，第六个容器用做对照。如果

数据不充分，无法确定正式试验所需要的浓度范围，则另选一个浓度范围进行试验。

7.1.2将溶液在23f1℃恒温。试验时间为2445h。向每个容器放五尾鱼，每天至少记录两次每个容

GB/'r13267一91

器中的死鱼数目及溶解氧浓度，并及时将死鱼取出。

7.1.3如果采用流水式试验.则应用流水法做预备试验。

7.1.4测定废水样品时，应当首先测定废水样品的溶解氧含量并了解废水的大致性质。只有废水含有

适量的溶解氧时，才能不经稀释进行毒性试验。

了.2正式试验

7.2.1从24h预备试验中杀死全部鱼的最低浓度与未毒死鱼的最高浓度之间，以几何级数做间距，至

少选择5个浓度为正式实验的浓度。其浓度范围在三个依次的几何系列浓度中最好能够测得20%到

80%的死亡率以估计LC50值。

7.2.2至少取6个容器(流水式试验用6个2L的烧瓶与辅助设备连好)，均加入标准稀释水。其中一

个为空白试验即对照试验，其余容器中加入不同量的储备溶液，以得到所要求的浓度范围。如果用有机

溶剂溶解物质，则需配制第二个“对照”溶液，使标准稀释水中有机溶剂的浓度与试验液中有机溶剂的最

高浓度相当。将试验液温度恒定在23士10C，按下述方法向每个容器中放入10尾或更多的试验鱼。

用尼龙或其他软惰性材料编织的小孔抄网从驯养鱼群中随机选取鱼放人试验容器中。取要迅速，在

鱼转移过程中因操作不慎掉下的鱼或其他操作不善的鱼弃去不用。所有的鱼需在30min内转移完毕。

7.2.3使用换水式试验时，8-24h更新一次试验液(视试验物质的性质、溶解氧等具体情况而定)，立

即将试验鱼转移到其中去。转移时从最低浓度开始依次向高浓度过渡，避免因使用抄网造成的各容器间

试验物质的明显转移。

7.2.4流水式试验时，启动流水装置，更新溶液的速率至少为25L/d。如果出口溶液的溶解氧浓度能

维持大于600oASV，则更新速率可以低到12L/d。可连续更新，也可在短时间内间歇更新。用于更新的

试液的温度需控制在23士I'C。鱼转移的方法同7.2.2,

7.2.5随时观察并记录试验鱼的平衡、游动、呼吸、体色变化等中毒症状。试验开始后3-6h内要特别

注意观察。每天至少记录两次每个容器中的死鱼数目(用玻璃棒轻触鱼的尾部，没有反应即认为已死

亡)，及时清出死鱼。对照组的死亡率不得超过100o，对照组试验期间鱼的外表及行为不正常或病态鱼

也不得超过1000，否则要重新进行试验。

试验开始和试验结束时测定试验液及储备液中被测物质的浓度。

每天至少测定一次各试验液的溶解氧,pH和温度。试验开始和结束时亦要测定。斑马鱼急性毒性

观察记录表格见附录C,

8结果的表述

8.1直线内插法估算LC50

用简单的图示法估算LC50时，可绘制死亡百分率对试验物质浓度的曲线。采用线性刻度的坐标轴

时是一条S形的关系曲线，从引起50%死亡率的内插浓度值得到LC50值(见图2)0

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