DB35/T 1499-2015 水产养殖环境中杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素残留量的测定

ICS13.060.50

Z16

DB35

福建省地方标准

DB35/T1499—2015

水产养殖环境中杆菌肽、粘菌素及

维吉尼霉素残留量的测定

DeterminationofBacitracin,ColistinandVirginiamycinresiduesin

aquacultureenvironment

2015-02-28发布2015-06-01实施

福建省质量技术监督局发布

DB35/T1499—2015

前言

本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。

本标准由福建省海洋与渔业厅提出并归口。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准起草单位：福建省水产研究所、福建省渔业环境监测站、农业部渔业产品质量监督检验测试

中心（厦门）。

本标准主要起草人：罗冬莲、罗方方、钱卓真、汤水粉、叶玫、吴成业。

I

DB35/T1499—2015

水产养殖环境中杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素残留量的测定

警告：使用本标准的人员应有正规实验室工作的实验经验，应熟知下述化学处理操作和仪器操作安

全。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家

有关法规规定的条件。

1范围

本标准规定了水产养殖环境（水体和沉积物）中杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素M1残留量测定的高

效液相色谱-串联质谱法。

本标准适用于水产养殖环境（水体和沉积物）中杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素M1残留量的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

GB17378.3-2007海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输

3原理

水样经过滤、酸化后，采用固相萃取方法富集和净化；沉积物经甲醇-柠檬酸-磷酸氢二钠溶液超声

提取，乙二胺四乙酸二钠络合除杂，甲基异丁基甲酮萃取，固相萃取柱富集净化；高效液相色谱-串联

质谱法测定，基质匹配标准曲线法定量。

4试剂和材料1)

本标准所用试剂除非另有规定，使用的试剂为分析纯，水为GB/T6682-2008规定的一级水。

4.1硫酸粘菌素标准品：纯度≥78.3%。

4.2杆菌肽标准品：纯度≥77.0%。

4.3维吉尼霉素M1标准品：纯度≥95.0%。

4.4甲醇：色谱纯。

4.5甲酸：优级纯。

4.6正己烷：色谱纯。

4.7乙腈：色谱纯。

4.8一水柠檬酸。

4.9十二水磷酸氢二钠。

4.10甲基异丁基甲酮：色谱纯。

1)称取标准品的质量是按纯度修正过的质量。

1

DB35/T1499—2015

4.11乙二胺四乙酸二钠。

4.120.1mol/L的柠檬酸溶液：取一水柠檬酸（4.8）21.01g，用水溶解并稀释至1000mL。

4.130.2mol/L的磷酸氢二钠溶液：取十二水磷酸氢二钠（4.9）71.63g，用水溶解并稀释至1000mL。

4.14柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液：取0.1mol/L的柠檬酸溶液（4.12）1000mL和0.2mol/L的磷酸氢

二钠溶液（4.13）625mL，混合均匀。

4.15甲醇-柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液：取甲醇（4.4）300mL和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（4.14）

400mL，混合均匀。

4.160.1%的甲酸甲醇溶液：取甲酸（4.5）1mL，用甲醇（4.4）稀释至1000mL。

4.170.1%的甲酸水溶液：取甲酸（4.5）1mL，用水稀释至1000mL。

4.18定容液：取0.1%甲酸水溶液（4.17）80mL和乙腈（4.7）20mL，混合均匀。

4.190.1%甲酸乙腈溶液：取甲酸（4.5）1mL，用乙腈（4.7）稀释至1000mL。

4.20OasisHLB固相萃取柱：500mg/6mL；或相当者。

4.21OasisHLB固相萃取柱：200mg/6mL；或相当者。

4.22标准储备液：准确称取硫酸粘菌素（4.1）、杆菌肽（4.2）各20mg（精确至0.1mg）于100mL

棕色容量瓶中，用0.1%的甲酸水溶液（4.17）溶解并稀释至刻度，配制成200mg/L的混合标准储备液，

4℃下避光保存，有效期1个月；准确称取维吉尼霉素M1（4.3）10mg（精确至0.1mg）于100mL棕

色容量瓶中，用甲醇（4.4）溶解并稀释至刻度，配制成100mg/L的标准储备液，-18℃下避光保存，

有效期6个月。

4.23混合标准中间液：准确移取200mg/L粘菌素和杆菌肽混合标准储备液（4.22）1mL于10mL棕

色容量瓶中，用0.1%的甲酸水溶液（4.17）稀释至刻度，配制成20mg/L的混合标准中间液，4℃下避

光保存，有效期10天；准确移取100mg/L维吉尼霉素M1标准储备液（4.22）1mL于10mL棕色容量

瓶中，用甲醇（4.4）稀释至刻度，配制成10mg/L的标准中间液，4℃下避光保存，有效期2个月。

5仪器与设备

5.1高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。

5.2分析天平：感量0.1mg。

5.3天平：感量0.01g。

5.4离心机：4000r/min。

5.5涡漩混合器：3000r/min。

5.6离心管：50mL。

5.7水浴氮吹仪。

5.8水相滤膜：0.45µm。

5.9有机相针式过滤器：0.22µm。

5.10超声波清洗器。

5.11真空泵。

5.12固相萃取装置。

6样品的采集、制备与保存

6.1水样采集与保存

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DB35/T1499—2015

按GB17378.3-2007的规定，将现场采集的1L水样装入小口棕色玻璃瓶中，盖紧，避光运回实验室，

2℃～8℃保存。

6.2沉积物采集、制备与保存

按GB17378.3-2007的规定，将现场采集的500g沉积物样品装入棕色广口玻璃瓶中，盖紧，避光运

回实验室。剔除沉积物中砾石和杂物，置阴凉通风处风干后，经研磨，过80目筛后，储于小口玻璃瓶中，

于阴凉处保存。

7试样的前处理

7.1水样前处理

水样抽滤过膜（5.8）。移取100mL过滤的水样于三角瓶中，加入甲酸（4.5）调节pH至2.5～3.0。

OasisHLB固相萃取柱（4.20）依次用甲醇（4.4）5mL、水5mL预活化，上样，水15mL淋洗，控制流

速为每秒一滴，甲醇（4.4）3mL洗脱，收集全部洗脱液于玻璃试管中，40℃氮吹至干。用定容液（4.18）

1mL复溶，混匀，过0.22µm有机相针式过滤器，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

7.2沉积物前处理

7.2.1提取

称取5g±0.05g过筛后的沉积物样品于50mL离心管内，依次加入乙二胺四乙酸二钠（4.11）0.5g、

甲醇-柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（4.15）10mL、2000r/min涡旋混合1min，超声提取10min、3500r/min

离心5min，取上清液，残渣再加入甲醇-柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（4.15）10mL重复提取1次，合并

上清液至另一50mL离心管。

7.2.2液-液萃取净化

上述清液（7.2.1）中加入甲基异丁基甲酮（4.10）5mL，2000r/min涡旋混合1min，3500r/min离心

5min，将上层液转移至15mL玻璃试管中，重复上述操作一次。合并两次甲基异丁基甲酮提取液于40℃

氮吹至干，甲醇（4.4）1mL复溶后与下层液合并，待固相萃取柱净化。

7.2.3固相萃取净化

OasisHLB固相萃取柱（4.21）依次用甲醇（4.4）5mL、水5mL预活化，上样，水10mL淋洗，控

制流速为每秒一滴，甲醇（4.4）3mL、0.1%甲酸甲醇溶液（4.16）3mL依次洗脱，收集全部洗脱液于

玻璃试管中，40℃氮吹至干。用定容液（4.18）1mL复溶，混匀，过0.22µm有机相针式过滤器，供高

效液相色谱-串联质谱仪测定。

8测定

8.1液相色谱条件

8.1.1色谱柱：CAPCELLPAKMGIIC18柱（2.0mm×150mm,5µm）或性能相当者。

8.1.2流动相A：0.1%甲酸水溶液。

8.1.3流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液。

8.1.4梯度洗脱程序见表1。

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DB35/T1499—2015

表1流动相梯度洗脱程序

时间AB

min%%

09010

29010

42575

925