WS/T 633-2018 巴贝虫检测 虫种核酸鉴定法

ICS11.020

C61

WS

中华人民共和国卫生行业标准

WS/T633—2018

巴贝虫检测虫种核酸鉴定法

DetectionofBabesiaspp.——Identificationofspeciesbynucleicacidmethod

2018-09-26发布2019-04-01实施

中华人民共和国国家卫生健康委员会发布

WS/T633—2018

前  言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由国家卫生标准委员会寄生虫病标准专业委员会提出。

本标准起草单位：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、复旦大学、第二军医大学。

本标准起草人：刘琴、周晓农、张仪、胡薇、陈家旭、朱淮民。

I

WS/T633—2018

巴贝虫检测虫种核酸鉴定法

1范围

本标准规定了检测巴贝虫的虫种核酸鉴定法。

本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对巴贝虫的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

WS/T564巴贝虫病诊断

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

巴贝虫Babesiaspp.

一类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫，可引起巴贝虫病（babesiosis）。感染人体的巴贝虫种

类主要有田鼠巴贝虫(Babesiamicroti)、分歧巴贝虫（B.divergens）、邓肯巴贝虫（B.duncani）和猎户

巴贝虫（B.venatorum）等（参见附录A）。

4仪器和器材

4.1高速离心机

最大相对离心力为12000×g。

4.2涡旋仪

无级调速范围为200r/min～3000r/min。

4.3PCR扩增仪

温度范围为4℃～99℃，温度精确为0.1℃，热盖为105℃。

4.4微波炉

4.5电泳仪

电压为5V～5000V，电流为1mA～500mA。

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WS/T633—2018

4.6凝胶成像系统

镜头分辨率(H×V)为1360×1024，光源为透射UV。

5试剂和材料

5.1分子生物学试剂

Taq酶、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、分子质量指示物及核酸提取试剂盒选用商品化产品。

5.2化学试剂

Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）、琼脂糖凝胶、6×加样缓冲液（参见附录B）。

5.3引物

扩增巴贝虫18S核糖体RNA（18SrRNA）基因和转录间隔区（ITS）基因的特异性引物（见附录

C）。

5.4参照材料

阳性对照为田鼠巴贝虫peabodymjr株基因组DNA。

空白对照为去离子灭菌水。

阴性对照为健康人全血基因组DNA。

6检测步骤

6.1样品

样品为临床诊断或疑似巴贝虫病病例抗凝血样品。

6.2虫种核酸鉴定

6.2.1核酸提取

基因组DNA提取采用商品化全血DNA提取试剂盒（参见附录B）。

6.2.218SrRNA基因扩增

见附录C。

6.2.3ITS基因扩增

见附录C。

6.2.4结果判定

电泳分析

.1电泳

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WS/T633—2018

取第二轮PCR产物5µL与1μL6×加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭替代物的1.0％琼脂糖凝胶

中，在1×TAE缓冲液中，5V/cm电泳约40min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统或

紫外分析仪分析。

.2PCR结果判断

.2.1PCR扩增巴贝虫18SrRNA基因，出现大小为400bp左右特异性的扩增片段，空白对

照和阴性对照未出现条带，PCR结果阳性。PCR扩增巴贝虫18SrRNA基因，未出现大小为400bp左

右特异性的扩增片段，空白对照和阴性对照未出现条带，PCR结果阴性。

.2.2PCR扩增巴贝虫ITS基因，出现大小在700bp～2100bp的特异性的扩增片段，空白对

照和阴性对照未出现条带，PCR结果阳性。PCR扩增巴贝虫ITS基因，未出现特异性的扩增片段，空

白对照和阴性对照未出现条带，PCR结果阴性。

测序分析

阳性PCR扩增产物进行双向测序，将序列进行BLAST比对分析（见附录C）。

虫种鉴定

根据PCR扩增产物电泳结果与测序结果分析，综合判定虫种种类（见附录C）。

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WS/T633—2018

AA

附录A

（资料性附录）

病原生物学

A.1分类

巴贝虫（Babesiaspp.）属于顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoa）、梨形虫亚纲

（Piroplasmasina）、梨形虫目（Piroplasmida）、巴贝虫科（Babesiidae）的巴贝虫属（Babesia）。目前

已鉴定的有100多种巴贝虫，可以感染牛、马、羊、犬等多种哺乳动物和鸟类。在100多种巴贝虫中，既

往已知可以感染人的巴贝虫种类主要有：田鼠巴贝虫(B.microti)、分歧巴贝虫（B.divergens）、邓肯巴

贝虫（B.duncani，也称为WA1）和猎户巴贝虫（B.venatorum，也被称为EU1）等。不同巴贝虫虫种引

起人体临床症状的比较见表A.1。

A.2分布

本病呈地方性流行。

在美国，巴贝虫病病例主要发现于马萨诸赛岛、纽约州、康涅狄格岛、加利福尼亚州以及罗得岛。

在欧洲，法国、葡萄牙、意大利、波兰、挪威等地均有人巴贝虫病病例发生。另外，在埃及、墨西哥、

澳大利亚、日本、韩国、巴基斯坦及南非也均有人巴贝虫病病例报道。

在我国云南、河南、新疆、山东、陕西、浙江、江苏、广西、福建及台湾、香港地区等地均有人巴

贝虫病病例报道。

表A.1不同巴贝虫虫种引起人体临床症状的比较

虫种地理分布媒介名称潜伏期临床特征其他

田鼠巴贝虫欧洲、美国、肩突硬蜱、1周~6周，甚至3大多数患者症状比较轻微，只出现一过一般以50岁以上

（B.microti）日本、中国、卵形硬蜱、个月以上性的发热症状；而重症患者出现疟疾样的老人易感

埃及等全沟硬蜱、症状，包括发热、寒战、肌肉疼痛、贫

丹敏硬蜱血、无力、肝脾肿大、溶血性贫血等

分歧巴贝虫欧洲篦子硬蜱1周~3周突然起病、血红蛋白尿、黄疸、休克样脾脏切除和免疫

（B.divergens）表现缺陷者易感

邓肯巴贝虫欧洲、美国丹敏硬蜱、3周~2个月发热、寒战、肌肉疼痛、贫血、无力、脾脏切除患者易

（B.duncani）等肩突硬蜱肝脾肿大、溶血性贫血，持续数周或更感；易输血传播

长

猎户巴贝虫欧洲、中国蓖子硬蜱、不明确大多数患者症状比较轻微，只出现一过免疫功能低下者

（B.venatorum）等卵形硬蜱性的发热症状；严重者表现贫血、血红或者脾切除患者