DB44/T 664-2009 鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感（H5亚型）的H1和多重RT-PCR鉴别诊断技术操作规程

ICS65.020.30

B41

备案号：25946-2009DB44

广东省地方标准

DB44/T664—2009

鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感

（H5亚型）的HI和多重RT-PCR

鉴别诊断技术操作规程

HIandmultiplexRT-PCRfordetectionanddifferentiation

betweenGPMVandH5subtypeofAIVingoose

2009-08-06发布2009-12-01实施

广东省质量技术监督局发布

DB44/T664—2009

前言

本标准附录A、附录B和附录C为规范性的附录。

本标准由广东省农业厅提出并归口。

本标准起草单位：华南农业大学兽医学院。

本标准主要起草人：任涛、徐成刚、罗开健、曹伟胜、袁少华、廖明、张桂红、辛朝安。

I

DB44/T664—2009

鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感（H5亚型）的

HI和多重RT-PCR鉴别诊断技术操作规程

1范围

本标准规定了应用血凝抑制试验（HI试验）和反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术鉴别诊断鹅的

禽副粘病毒病与H5禽流感的材料准备、操作方法及结果判定。

本标准适用于鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感(H5亚型)的鉴别诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修

改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否

可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T18936高致病性禽流感诊断技术。

3术语和定义

GB/T18936确定的以及下列术语和定义适用于本标准。

3.1

鹅的禽副粘病毒病

是近年来的新病，是由鹅的禽副粘病毒（GooseParamyxovirus,GPMV）引起的鹅的一种高发病率、

高死亡率的烈性传染病，以消化道充血、出血为特征的急性传染病。

3.2

高致病性禽流感HighlyPathogenicAvianInfluenzaVirus

是由正黏病毒科流感病毒属的禽类高致病性A型流感病毒(主要为H5亚型)引起的一类急性、高接触

性的禽类烈性传染病，具有高发病率和高死亡率的临床特征。

3.3

红细胞凝集试验

是指感染禽类的某些病毒与红细胞发生结合出现红细胞凝集的现象。

3.4

血凝效价

是指红细胞凝集试验中出现红细胞凝集现象的最高稀释倍数，一般以log2为单位。

3.5

红细胞凝集抑制试验

即HI试验，是指使用特异性免疫血清可以抑制某些感染禽类的病毒与红细胞凝集的现象。

3.6

血凝抑制效价

是指HI实验中不出现红细胞凝集现象的最高稀释倍数，一般以log2滴度为单位。

3.7

四单位抗原

根据抗原HA效价结果进行稀释，配制出血凝效价为2个log2单位的抗原稀释液。

1

DB44/T664—2009

3.8

反转录聚合酶链反应ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction

是指利用反转录酶将病毒RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增的检测方法。RT-PCR使

RNA检测的敏感性提高了几个数量级，使一些极为微量的RNA样品分析成为可能。

3.9

特异性引物

是指针对特定模板DNA基因片段设计的一小段与DNA片段两侧互补的人工合成寡核苷酸。

3.10

无RNase水

是指除去RNA酶活性的双蒸水。

4HI试验

4.1仪器设备及材料

4.1.1仪器设备：离心机，最大转速至少应达到5000g；微量振荡器；96孔V型板；5μL～50μL八道移

液器。

4.1.2材料：1mL、10mL吸管；10mL离心管；2mL一次性注射器。pH值为7.4,浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓

冲溶液（PBS）；3.8%柠檬酸钠抗凝剂；1％鹅红细胞悬液；GPMV和HPAIV抗原、标准血清以及阴性血清。

试剂的配方见附录B

4.2采样与样品制备：每只鹅心脏或翼下采血1mL～2mL,静置或离心，待血清析出后备用。

4.3操作规程

4.3.1HA效价的测定

在96孔V型反应板的1孔～12孔均加入25μLPBS，换吸头；吸取GPMV或HPAIV25μL于第1孔中混匀后

吸出25μL至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，从第11孔吸取25μL弃去并换吸头；同样，换吸头后取25μL

AIV进行在另外一排孔中进行同样的操作，有必要的话，每种抗原可以重复做一排；每孔加入25μLPBS；

吸取1%鹅红细胞悬液依次加入各孔，每孔25μL；置于微量振荡器上振荡30s，室温（20℃～25℃）静置40min

后观察结果；对照孔（12孔）红细胞应成明显纽扣状沉到孔底，此时根据完全血凝的最高稀释倍数得出HA

效价。

4.3.2四单位抗原校正

用微量移液器向反应板的2孔～6孔加PBS25μL,第1孔不加；根据4.3.1HA效价的测定结果配制

四单位GPMV及HPAIV抗原，用微量移液器吸取25μL四单位抗原分别加入第1孔、第2孔中，从第2孔

开始混匀后吸出25μL至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25μL；每孔加入25μLPBS；用微量移

液器再吸取1%鹅红细胞悬液依次加入1孔～6孔，每孔25μL；于微量振荡器上振荡30s；室温（20℃～

25℃）静置40min后观察结果；如第1、2、3孔为完全凝集，第4孔红细胞为50%沉淀，第5孔红细胞产

生75%的沉淀，第