DB12/T 866-2019 水和沉积物中孔雀石绿及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

ICS65.150

B50

DB12

天津市地方标准

DB12/T866—2019

水和沉积物中孔雀石绿及其代谢物残留量

的测定液相色谱-串联质谱法

Determinationofmalachitegreenanditsmetaboliteresiduesinwaterandsediment

byhigh-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry

2019-01-14发布2019-02-15实施

天津市市场监督管理委员会发布

DB12/T866—2019

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由天津市渔业发展服务中心提出并归口。

本标准起草单位：农业农村部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（天津）。

本标准主要起草人：陈永平、李春青、时文博、高丽娜、李宝华。

I

DB12/T866—2019

水和沉积物中孔雀石绿及其代谢物残留量的测定液相色谱-串联质

谱法

1范围

本标准规定了水质及沉积物中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留量测定的试剂、仪器设备、测定步骤、

计算、方法灵敏度、方法回收率、方法精密度。

本标准适用于水和沉积物中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留量检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

沉积物中孔雀石绿(MalachiteGreenMG)及其代谢物无色孔雀石绿（LeucomalachiteGreenLMG）

残留提取，利用N，N，N'，N'-四甲基对苯二胺(2,3,5,6-tetramethyl-1,4-phenylenediamineTMPD)

解吸附后，二氯甲烷萃取。水中孔雀石绿和无色孔雀石绿二氯甲烷提取，质谱检测器检测，内标法定量。

4试剂

4.1孔雀石绿及无色孔雀石绿标准品：孔雀石绿纯度＞98%，无色孔雀石绿纯度＞98%。

4.2乙腈：色谱纯。

4.3甲醇：色谱纯。

4.4二氯甲烷。

4.5实验用水符合GB/T6682一级水指标

4.62.0mmoL·L-1乙酸铵缓冲溶液：称取0.077g无水乙酸铵溶解于适量水中，再加入0.5mL甲酸，

再加水定容至500mL。

4.7TMPD溶液(1.0mg·mL-1)：称取50mgN，N，N'，N'-四甲基对苯二胺（TMPD）溶于50mL甲醇

中。

4.8孔雀石绿（MG）、无色孔雀石绿(LMG)标准储备液（100μg·mL-1）：准确称取适量的孔雀石绿、无

色孔雀石绿标准品，分别用乙腈溶解并定容，于-18℃避光保存，可使用1年。

4.9氘代孔雀石绿（MG-D5）和氘代无色孔雀石绿（LMG-D6）内标标准储备液（100μg·mL-1）：准确称

取适量的氘代孔雀石绿和氘代无色孔雀石绿标准品，分别用乙腈溶解并定容，于-18℃避光保存，可使

用1年。

4.10混合外标标准中间液（1.0μg·mL-1）：分别准确吸取1.0mL孔雀石绿和无色孔雀石绿的标准储

备液（4.7）于100mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，于-18℃避光保存，可使用6个月。

1

DB12/T866—2019

4.11混合内标标准中间液（1.0μg·mL-1）：分别准确吸取1.0mL氘代孔雀石绿和氘代无色孔雀石绿

标准储备液（4.8）于100mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，于-18℃避光保存，可使用6个月。

4.12混合外标标准使用液（0.10μg·mL-1）：准确吸取1.00mL混合外标标准中间液（4.9）于10.0mL

容量瓶中，用乙腈稀释定容，于-18℃避光保存，可使用1个月。

4.13混合内标标准使用液（0.10μg·mL-1）：准确吸取1.00mL混合内标标准中间液（4.10）于10.0

mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，于-18℃避光保存，可使用1个月。

4.14混合标准工作液：临用时准确吸取相应体积的混合外标标准使用液（4.11），再加入混合内标标

准使用液（4.12）20μL，用乙腈和2.0mmoL·L-1乙酸铵缓冲溶液（1:1，V/V）稀释定容至1mL，标准

曲线系列浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20ng·mL-1，现用现配。

注：除特殊注明外，所有试剂均为分析纯。

5仪器和设备

5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾（ESI）离子源。

5.2电子天平：感量1.0mg和0.01mg。

5.3高速冷冻离心机：可制冷到4℃（最大转速高于10000r/min）。

5.4超声波震荡仪。

5.5涡旋振荡器。

5.6移液器(10μL，20μL，50μL，100μL，1000μL)。

5.7旋转蒸发仪。

5.8纯水器。

5.9冰箱：具有4℃冷藏箱和达到-18℃以下冷冻箱。

6测定步骤

6.1样品制备

6.1.1水：将采集水样过0.45µm滤膜，收集水样体积1L，于4℃冰箱保存，6d内测定。

6.1.2沉积物：将沉积物置于阴凉处风干，研磨过筛（150目），收集沉积物质量20g，于4℃冰箱

保存，6d内测定。

6.2样品处理

6.2.1水：量取水样500mL，置于分液漏斗中，加入40μL混合内标标准使用液（4.12），再加入30

mL的二氯甲烷，振摇5min，静置30min，取下层二氯甲烷于锥形瓶中，再加入30mL二氯甲烷重复

一次，若分层不明显，取其下层液于50mL离心管中，冷冻离心机6000r/min离心3min，再取下层

液，合并于锥形瓶中，旋转蒸发温度30℃，旋转蒸发浓缩至近干，残留物加入2.0mL的乙腈-2

mmoL·L-1乙酸铵溶液(1∶1，V/V)（4.5），涡旋振荡1min，超声波振荡2min，过0.22μm有机相滤

膜后，上机测定。

6.2.2沉积物：称取粉末状沉积物样品(5.0±0.01)g于50mL聚乙烯离心管中，先加入200μLTMPD

溶液（4.6），再加入40μL混合内标标准使用液（4.12），加入20mL二氯甲烷，涡旋2min，超声

波震荡25min，6000r/min离心5min，取上层液于锥形瓶中，再向离心管中加入20mL二氯甲烷，

重复上述操作，合并上清液锥形瓶中，旋转蒸发温度30℃，旋转蒸发浓缩至近干，残留物加入2.0mL

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DB12/T866—2019

的乙腈-2mmoL·L-1乙酸铵溶液(1∶1，V/V)（4.5），涡旋振荡1min，超声波振荡2min，过0.22μm

有机相滤膜后，上机测定。

6.3标准工作曲线制作

分别准确移取100ng·mL-1混合外标标准使用液（4.11），乙腈稀释至0.50ng·mL-1、1.0ng·mL-1、

2.0ng·mL-1、5.0ng·mL-1、10.0ng·mL-1、20.0ng·mL-1混合标准工作液，内标液浓度均为2ng·mL-1，供

液相色谱-串联质谱仪测定。

6.4测定

6.4.1色谱条件

色谱柱：C8柱，2.2μm，75mm×2.1mm（内径），或相当。

柱温：35℃。

样品室温度：15℃。

流动相A：含0.1%甲酸的2.0mmoL·L-1的乙酸铵水溶液；流动相B：0.1%甲酸-乙腈溶液；进样体积：

5.0μL；具体参数见表1。

流速：0.25mL·min-1。

表1流动相梯度洗脱程序

时间（min）A/%B/%

0.13070

23070

7298

9298

9.013070

113070

6.4.2质谱条件

离子化模式：电喷雾离子源（ESI），正离子模式。

离子源温度：600℃。

气帘气：25；碰撞气：中；喷雾电压：5000v；辅气1：60；辅气2：40。

扫描模式：多反应监测（MRM，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2目标化合物质谱条件

目标化合物母离子(m/z)子离子(m/z)去簇电压(v)碰撞能量(ev)

20812038

MG329

313*12038

316.1*12020

LMG331.1

239.1