LY/T 2347-2014 刚竹属DNA扩增片段长度多态性(AFLP)分析方法

ICS65.020.20

B65

中华人民共和国林业行业标准

/—

LYT23472014

刚竹属扩增片段长度多态性()

DNAAFLP

分析方法

ㅤㅤㅤㅤ

()

MethodofDNAamlificationframentlentholmorhismAFLP

pggpyp

forPhllostachsbamboo

yy

2014-08-21发布2014-12-01实施

国家林业局发布

/—

LYT23472014

刚竹属DNA扩增片段长度多态性()

AFLP

分析方法

1范围

本标准规定了刚竹属()、、、

Phllostachs竹种的DNA提取酶切连接扩增实验步骤及采用的仪器

yy

设备。

本标准适用于刚竹属竹种DNA多态性的分析。

2试剂

,。

2.1所用化学试剂如没有特殊说明均为分析纯

:/、(/,/

2.2DNA提取液1molLTris-HClH8.2细胞裂解液1molLTris-HClH7.50.25molLED-

pp

,/,),

氯化钠与按混合在使用前加入亚硫酸钠至终浓

TAH8.05molL2%CTAB5%SLS5∶5∶2

p

度为/。

0.02molL

三氯甲烷异戊醇。

2.3∶=24∶1

2.4异丙醇。

乙醇:无水乙醇加蒸馏水定容到。

2.570%70mL100mL

/:,。

氯化钠称取氯化钠用蒸馏水溶解后定容到

2.65molL29.22gㅤㅤㅤㅤ100mL

/:,容到。

2.70.5mmL溴化乙锭称取5m溴化乙锭用蒸馏水溶解后定10mL

gg

:,(/,),,

2.8变性缓冲液去离子甲酰胺50mLEDTA0.5molLH=8.01mL二甲苯青FF0.125g溴酚

p

蓝0.125g。

:,,/(),。

2.910×TBETris108.0硼酸55.00.5molLEDTAH8.040mL定容到1000mL

ggp

2.1040%丙烯酰胺溶液:甲叉双丙烯酰胺,丙烯酰胺混合加水定容到。

2.0g38.0g100mL

2.1110%过硫酸胺溶液:过硫酸胺加水定容到。

1.0g10mL

3仪器

(,)。

3.1PCR仪具有touchdown功能温度精度±0.2℃

3.2移液器。

低温离心机(/以上)。

3.34℃max14000rmin

3.4水浴锅。

()。

3.5电泳仪可满足DNA测序

3.6紫外分光光度计。

3.7分析天平。

3.8摇床。

4试验步骤

4.1DNA提取

按照附录的方法提取和检测竹子基因组。电泳检测主带完整、;

ADNADNA平均分子量>20kb

1

/—

LYT23472014

纯度为/。

1.8<ODOD<2.0

260280

4.2酶切反应

对所选样品采用/双酶切:

EcoRⅠMseⅠ

():;(/);(/);

酶切体系为酶切缓冲液模

20L10×2LEcoRI10UL0.4LMseI10UL0.4L

μμμμμμ

;。

板DNA200ng加超纯水至20L

μ

,;。

酶切反应条件为37℃3h反应结束后65℃10min使内切酶失活

4.3连接反应

接头序列参照附录B。

():;(/);(/)

反应体系为缓冲液接头接头

20L10×T42LEcoRI50molL1LMseI50molL

μμμμμ

;(/);;。

1LT4DNA连接酶5UL0.4L酶切产物10L加超纯水至20L

μμμμμ

连接反应条件为:过夜。

4℃

4.4预扩增反应

预扩增引物参照附录B。

反应体系为:缓冲液;(/);酶(/);预扩增引物

10×2LdNTPs10mmolL0.4LTa5UL0.2L

μμqμμ

(/);(/)