DB13/T 2598-2017 花生品种真实性与纯度鉴定SSR法

ICS67.060

B22

DB13

河北省地方标准

DB13/T2598—2017

花生品种真实性与纯度鉴定SSR法

2017-11-22发布2017-12-22实施

河北省质量技术监督局发布

DB13/T2598—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由河北农业大学提出。

本标准起草单位：河北农业大学。

本标准主要起草人：杨鑫雷、刘立峰、崔顺立、郭丽果、陈焕英、穆国俊、李洪珍。

I

DB13/T2598—2017

花生品种真实性与纯度鉴定SSR法

1范围

本标准规定了利用SSR标记对花生品种真实性与纯度进行鉴定的术语和定义、原理、试剂材料、操

作程序、数据分析和判定规则。

本标准适用于利用SSR法对花生品种真实性与纯度鉴定的试验过程。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2-1995农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4-1995农作物种子检验规程发芽试验

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

品种真实性（VarietalGenuineness）

供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。

3.2

品种纯度（VarietalPurity）

品种在特征特性方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的百分率表

示。

3.3

简单重复序列SSR（SimpleSequenceRepeat）

基因组中以几个核苷酸（一般为2个～6个）为重复单元的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序

列，又称微卫星标记。

注：由于基本单元重复次数的不同，形成了SSR长度的多态性。

3.4

聚合酶链式反应PCR（PolymeraseChainReaction）

一种用于在体外扩增DNA序列的技术程序。

注：模板DNA经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜温度下，两条引物分别与DNA模板两条链上的一段互补

序列发生退火，并在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP(deoxy-ribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷三磷酸）为底

物，使退火引物延伸从而合成DNA。如此变性退火和合成DNA反复循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几

何倍数扩增。

1

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3.5

引物Primer

结合在模板DNA上的互补短链，提供3＇-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补

链。

3.6

核心引物CorePrimer

SSR标记分析优先选用多态性高、稳定性好，识别能力强的一套引物的引物。

3.7

标准样品StandardSample

代表已知品种特征特性的育种家种子作为标准样品。

4原理

花生基因组中存在着大量简单重复序列（SSR），由于SSR单元在不同基因型间重复次数不同，因

此同一位点的SSR在不同品种间往往具有丰富的长度多态性。利用PCR技术扩增每个位点的简单重复序

列，通过电泳分析其长度多态性，达到区别不同花生品种的目的。

5试剂或材料

警示：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺具神经毒性，配制时应注意防护。

除非另有说明，使用分析纯试剂和重蒸馏水应符合GB/T6682规定的一级水。

5.1三羟甲基氨基甲烷（Tris）：分子式为C4H11NO3,CAS77-86-1。

5.2氯化锂(LiCl)：CAS7447-41-8。

5.3乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA·Na2）：分子式为C10H16N2O8Na2·2H2O，CAS60-00-4。

5.4十二烷基硫酸钠(SDS)：分子式为C12H25NaO4S，CAS151-21-3。

5.5聚乙烯吡咯烷酮（PVP）：分子式为(C6H9NO)41，CAS9003-39-8。

5.6β-巯基乙醇：分子式为C2H6OS，CAS60-24-2。

5.7酸酚（acidphenolpH4.3）。

5.8异戊醇：分子式为C5H12O，CAS123-51-3。

5.9Tris饱和酚（pH8.0）。

5.10三氯甲烷：分子式为CHCl3，CAS67-66-3。

5.11无水乙醇：分子式为C2H6O，CAS64-17-5。

5.12硫氰酸胍：分子式为CH5N3·CHNS，CAS593-84-0。

5.13二水柠檬酸钠：分子式为C6H9Na3O9，CAS6132-04-3。

2

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5.14乙酸铵：分子式为C2H7NO2，CAS631-61-8。

5.15十二烷基肌氨酸钠：分子式为C15H28NO3·Na，CAS137-16-6。

5.16异丙醇：分子式为C3H8O，CAS67-63-0。

5.17氯化钠：分子式为NaCl，CAS7647-14-5。

5.18氢氧化钠：分子式为NaOH，CAS1310-73-2。

5.19TaqDNA聚合酶：保存条件为-20℃±2℃。

5.20四种脱氧核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），缩略为dNTPs。

5.21硼酸：分子式为BH3O3，CAS11113-50-1。

5.22丙三醇：分子式为C3H8O3，CAS56-81-5。

5.23溴酚蓝：分子式为C19H10Br4O5S，CAS115-39-9。

5.24二甲苯氰FF：分子式为C25H27N2NaO7S2，CAS4463-44-9。

5.25丙烯酰胺：分子式为C3H5NO，CAS79-06-1。

5.26甲叉双丙烯酰胺：分子式为C7H10N2O2，CAS110-26-9。

5.27N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）：分子式为C10H24N2，CAS150-77-6。

5.28过硫酸铵：分子式为H8N2O8S2，CAS7727-54-0。

5.29冰醋酸：分子式为C2H4O2，CAS64-19-7。

5.30硫代硫酸钠：分子式为Na2O3S2，CAS7772-98-7。

5.31硝酸银：分子式为AgNO3，CAS7761-88-8。

5.32甲醛溶液：分子式为CH2O，CAS50-00-0。

5.331mol/LTris-HCl溶液

121.1gTris碱溶于适量水中，加HCl调pH至7.5，定容至1L，1.05kg/cm2高压蒸汽灭菌15min，

4℃贮存。

5.344mol/LLiCl溶液

称取84.78gLiCl置于烧杯中，加入500mL去离子水，搅拌溶解，室温保存。

5.3515%(w/v)SDS溶液

称取15gSDS至于烧杯中，加入800mL的去离子水。68℃加热溶解，加浓盐酸调节pH值至7.5，定

容至100mL,室温保存。

5.360.5mol/LEDTA溶液

称取187.61gEDTA-Na2·2H2O溶于800mL去离子水中，用固体NaOH调pH值至7.5，定容至1L，1.05

kg/cm2高压蒸汽灭菌15min，4℃贮存。

3

DB13/T2598—2017

5.37溶液Ⅰ

称取20gPVP溶于500mL去离子水中，然后加入100mL1mol/LTris-HCl，100mL0.5mol/LEDTA，

100mL15%SDS，37.5mLLiCl，15mLβ-巯基乙醇（用时现加），定容至1L，4℃贮存。

5.38氯仿：异戊醇体积比为24：1。

5.39酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1。

5.40溶液Ⅱ

称取236.32g硫氰酸胍,147.05g二水柠檬酸钠,115.62g乙酸铵,10g十二烷基肌氨酸钠溶

于800mL去离子水中,加乙酸调节pH值至5.2，定容至1L，4℃贮存。

5.411.2mol/LNaCl溶液

称取35.06gNaCl溶于500mL离子水中，室温贮存。

5.4270%无水乙醇溶液

5.43加样缓冲液

称取EDTA0.88g、溴酚兰0.05g、二甲苯氰FF0.05g于烧杯中，然后加入40mL去离子水，加热搅

拌至充分溶解，再加入36mL丙三醇，加2mol/LNaOH调pH值至7.0，定容至100mL，4℃贮存。

5.4430%非变性聚丙烯酰胺溶液

称取290g丙烯酰胺、410g甲叉双丙烯酰胺于烧杯中，然后加入600mL去离子水，室温充分溶解,

加去离子水定溶至1L，过滤，4℃贮存。

5.4510%过硫酸铵溶液

10%（g/mL）过硫酸铵。4℃贮存。

5.4610×Tris/硼酸电泳缓冲液（10×TBE）

2

称取108gTris、7.44gNa2EDTA/硼酸55g至于烧杯中，加去离子水溶解并定容至1L。1.05kg/cm

高压蒸汽灭菌15min，4℃贮存。

5.471%硫代硫酸钠

1%（g/mL）硫代硫酸钠。室温贮存。

5.48固定液

其中含10%（体积比）无水乙醇和0.5%（体积比）冰乙酸，既用即配。

5.49染色液

0.2%（g/mL）AgNO3，即用即配。

5.50显影液

其中含1.5%（g/ml）NaOH和0.4%（体积比）甲醛，即用即配。

4

DB13/T2598—2017

6仪器设备

6.1PCR扩增仪：96孔，0.2mL。

6.2高速冷冻离心机：最大离心力≥12,000g。

6.3电泳检测系统：垂直电泳系统。

6.4微量移液器：规格分别为2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL，连续可调。

6.5低温冰箱：最低温度-20℃。

6.6高压灭菌锅：120℃±2℃。

6.7