GB/T 27634-2011 传染性囊病病毒核酸检测方法

ICS11.220

B41

道昌

共

中华人民和国国家标准

GB/T27634-2011

传染性囊病病毒核酸检测方法

Protocolofnucleicaciddetectionforinfectiousbursaldisease

(gumborodisease)virus

2012-04-01实施

2011-12-30发布

中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局

发布

中国国家标准化管理委员会

GB／τ27634-2011

=

前

军＝事

-

本标准按照GB/T1.12009绘出的规则起草。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。

本标准起草单位s中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、华南农业

大学、中华人民共和国珠海出人撞检验检疫局、北京盈九恳科技有限公司，

本标准主要起草人＝秦智锋、壳、洁、卢体康、花群义、陈书混、吕建强、杨素、方兴眨、曾少灵、詹爱军飞

毕英佐、拣兵、玩周曦、朱玉兰。

I

GB/T27634-2011

传染性囊病病毒核酸栓测方法

1范围

本标准规定了传染位囊病病毒RT-PCR检测方法和实时荧光RT-PCR检泌方法的技术要求和操

作妮范。

本标准适用子传染性囊病病毒感染的快速诊阪．

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的e凡是注目期约引用文件，仅注目期的版本适用于本文

件a凡是不注目巍的引用文件，其最新版本〈包括所有的修改单〉适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T180豁出入境动物检疫采祥

GB19489实验室生物安全通用要求

3绩略语

下列缩略语适用于本文件。

Ct值2荧光信号量达到设定的词值时所经历的循环数。

IBD,infectio出』盯saldisease，传染性囊病．

IBDV,infectiousbursa!diseasevirus，传染性囊病病毒，

SPF,specificpathogenfree，无特定病原体雹

4材料与试剂

4.1仪器与耗桥

4.I.1核酸电泳仪。

4.1.2凝重量成像仪。

4.1.3冷冻离心机〈最高离心力达15OOOg以上）－

4.1.4混匀器．

4.1.5冰箱（Z℃～S℃，2号℃，－80℃λ

4.I.6微量可满移液器（10f'L,100f'L,l000µL）。

4.1.7微量带滤芯吸嘴(10µL,100µL,1000严L)o

4.1.8灭菌研钵雹

4.1.9离心管，

4.1.10PCR光学反应管。

在1.11FCR仪a

4.1.12实时荧光PCR仪，

1

GB/T27634-2011

4.2试报

4.2.1试J'flj级;!JIJ：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682娓定的二级水，所用化学试剂均为

分析绳。

4.2.2号：物与皇军针z采用无D'.\IA酶、无RNAE每水将每条引物与探针配制成100µmol/L储存液，置

-20℃或更低温度冻存；使用时取适量配秘成lGµmol/L工作液，避免多次冻融a

4.2.3灭茵双蒸水。

4.2.毒三靠在甲烧。

4.2.5异丙董事．

4.2.6元水乙醇，

4.2.775%乙董事z用薪开启的灭菌双蒸水配哥哥，一20℃预冷。

4.2.8DL2号00DNAMarker,

4.2.9一步法RTPCR检测试J'flj盒。

4.2.10一步法实时荧光RTPCR检草草试剂盒。

5生物安全要求

5.1采祥、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守GB19489始有关规定。

5.2IBDV核酸检测方法的实验室规范〈参见附录A〕。

6样品的采集

6.1按照GB／τ18088的要求送行样品的采集．

6.2样品包括各矜病料、用于IBDV监测和检溅1¥1冀组织、IBDV的细胞续养液、IBDV接种鸡胚的尿

囊液等。

7核酸搞建

7.1画三氯甲娱披提法

7.1.1取灭菌的1.5mL离心管萝做好标识。

7.1.2每管加入600µL裂董事液，分别加入被检样本、阴性对照（SPF鸡刽法氏囊组织PBS研磨上清

液〉、阪住对照（标准的IBDV毒夺最〉各200!LL，再加人200ILL三氯串滨，混匀器上振荡？冕匀5s，于4℃

12OOOg离心15min,

7.1.3取无RNA酶的1.5mL离心管，加入－20℃预冷400俨L异丙醇，吸取本标准7.1.2各管中的

上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀。

7.1.4于4℃12OOOg离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾于液体.:Im入600µL75%颈冷乙董事，

洗涤，

7.1.5子4℃12OOOg离心10mi毡，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，

7.1.610OOOg窍心10s，用微量力吉祥器将其吸子，室温干燥5min~10min,

7.1.7加入15µL无核酸降解酶的水，溶解管底的RNA,5OOOg离心5s，冰上保存备用．若需长期保

存应放置－70℃冰箱．

2

GB/T27634-2日11

7.2其他核酸摘提法

核酸提取可以采用等效R只A提取试J!IJ及方法，如采用自动化核酸拍击是工作站来抽提核酸，

8RT-PCR检测

8.1引物

8.1.1针对A片段VP2基嚣的51物

上游U3,5”TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GCA-TGC－＜χ汀－ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3’

下游L3,5'-CAG-