GB/T 46451-2025 手性氨基酸的测定 柱前衍生高效液相色谱串联质谱法

ICS07080

CCSA.40

中华人民共和国国家标准

GB/T46451—2025

手性氨基酸的测定柱前衍生高效

液相色谱串联质谱法

Determinationofchiralaminoacids—Highperformanceliquidchromatography

tandemmassspectrometrywithpre-columnderivatization

2025-10-05发布2026-05-01实施

国家市场监督管理总局发布

国家标准化管理委员会

GB/T46451—2025

前言

本文件按照标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则的规定

GB/T1.1—2020《1:》

起草

。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文的发布机构不承担识别专利的责任

。。

本文件由全国生化检测标准化技术委员会提出并归口

(SAC/TC387)。

本文件起草单位深圳市计量质量检测研究院深圳深检集团医学检验实验室中国测试技术研究

:、、

院深圳市药品检验研究院深圳市医疗器械检测中心深圳市农产品质量安全检验检测中心河北省

、()、、

食品检验研究院上海化工研究院有限公司中国检验认证集团湖南有限公司兰州百源基因技术有限

、、、

公司中国计量测试学会宜宾市检验检测中心

、、。

本文件主要起草人杨国武李子樱纪元孙丽萍唐淑军刘成文王进美金一宝罗敏匡慧颖

:、、、、、、、、、、

张玉鑫周李华王彧婕张岩史国华雷雯喻静兰秦美蓉李美芳刘尧王平王奇靳隆苏佳婷

、、、、、、、、、、、、、、

黄城益朱泽超陈欣赵云霞肖伟敏刘向荣杨扬仲夫车团结刘涵郑晓玲

、、、、、、、、、。

Ⅰ

GB/T46451—2025

手性氨基酸的测定柱前衍生高效

液相色谱串联质谱法

1范围

本文件描述了采用柱前衍生高效液相色谱串联质谱法检测丙氨酸丝氨酸脯氨

D-/L-、D-/L-、D-/L-

酸缬氨酸苏氨酸半胱氨酸亮氨酸异亮氨酸天冬酰胺

、D-/L-、D-/L-、D-/L-、D-/L-、D-/L-、D-/L-、D-/L-

天冬氨酸谷氨酰胺谷氨酸组氨酸苯丙氨酸精氨酸色氨酸

、D-/L-、D-/L-、D-/L-、D-/L-、D-/L-、D-/L-、

赖氨酸鸟氨酸瓜氨酸羟基脯氨酸α氨基己二酸磷酸丝氨酸

D-/L-、D-/L-、D-/L-、D-/L-、D-/L--、D-/L-、

犬尿氨酸氨基丁酸甲硫氨酸和酪氨酸的测定方法

D-/L-、D-/L-2-、D-/L-D-/L-。

本文件适用于生化试剂生物样本中上述游离手性氨基酸含量的测定

、。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中注日期的引用文

。,

件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于

,;,()

本文件

。

分析实验室用水规格和试验方法

GB/T6682

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件

。

31

.

游离手性氨基酸freechiralaminoacids

没有与其他氨基酸结合构成蛋白质或肽类物质的天然游离态氨基酸

。

注1包括游离氨基酸和游离氨基酸

:L-D-。

注2此类氨基酸不包括经化学或酶促水解蛋白质所产生的水解氨基酸

:。

4原理

试样中的蛋白质经磺基水杨酸蛋白沉淀处理后采用甲酸水溶液提取氨基酸在三乙胺的催化下与

,,

Nα氟二硝基苯基丙氨酰胺发生衍生反应衍生物用三重四极杆液相色谱串联质谱仪测

--(5--2,4-)-L-,

定内标法定量

,。

5试剂耗材

除非另有说明本方法所用试剂均为分析纯水为规定的一级水

,,GB/T6682。

51试剂

.

511甲醇号

..(CH3OH):CAS95713-52-3。

1

GB/T46451—2025

512乙腈号

..(C2H3N):CAS75-05-8。

513醋酸号

..(C2H4O2):CAS64-19-7。

514乙酸铵号

..(C2H7NO2):CAS631-61-8。

515丙酮号

..(C3H6O):CAS67-64-1。

516三乙胺号

..(C6H15N):CAS121-44-8。

517Nα氟二硝基苯基丙氨酰胺号

..--(5--2,4-)-L-(Marfey’sreagent,FDAA,C9H9FN4O5):CAS

纯度

95713-52-3,≥98%。

518甲酸号

..(CH2O2):CAS64-18-6。

519磺基水杨酸号

..(C7H10O8S):CAS5965-83-3。

52试剂配制

.

521乙腈水溶液吸取乙腈加入纯水涡旋混匀

..10%:10mL,90mL,。

522甲酸水溶液准确吸取甲酸于容量瓶中定容至刻度临用现配

..0.1%:(5.1.8)50.0μL50mL,。。

523磺基水杨酸水溶液准确称取磺基水杨酸用一级水溶解并转移至容量

..10%:2.50g(5.1.9)25mL

瓶中定容至刻度室温保存个月

,,3。

524衍生试剂准确称取用丙酮溶解并转移至容量

..3mg/mLFDAA:30.0mgFDAA(5.1.7)10mL

瓶中定容至刻度临用现配

,,。

525三乙胺溶液准确称取三乙胺用甲醇溶解并转移至容量瓶中定容至

..0.05mol/L:0.25g100mL,

刻度避光室温保存个月

,3。

526醋酸溶液准确称取醋酸用一级水溶解并转移至容量瓶中定容至刻

..0.1mol/L:0.60g100mL,

度室温保存个月

,3。

527乙酸铵水溶液准确称取乙酸铵用一级水溶解并转移至容量瓶中定容至

..10mmol/L:0.77g1L

刻度临用现配

,。

53标准物质/标准样品

.

氨基酸标准物质标准样品及稳定同位素内标物纯度或有证标准物质标准样品

L-/D-/,≥98%/。

对手持氨基酸的中文名称英文名称号分子式相对分子质量等详见附录

26、、CAS、、A。

54标准溶液配制

.

541外标标准储备液分别准确称取精确至各标准品用一级水溶

..(2000μg/mL):0.200g(0.0001g)

解并转移至容量瓶中定容至刻度避光保存保存期为个月

100mL,,4℃,3。

542种稳定同位素内标标准储备液分别准确称取精确至各标

..13(200μg/mL):0.020g(0.0001g)

准品用一级水溶解并转移至容量瓶中定容至刻度避光保存保存期为个月

100mL,。4℃,3。

543外标混合标准中间液准确移取各氨基酸外标标准储备液于

..(10μg/mL):125μL(5.4.1)25mL

容量瓶用一级水定容至刻度避光保存保存期为个月

,。4℃,3。

544内标混合标准中间液准确移取稳定同位素内标标准储备液于

..(10μg/mL):500μL(5.4.2)

容量瓶中用一级水定容至刻度临用现配

10mL,。。

545外标混合标准工作液准确移取外标混合标准中间液至容量瓶

..(4μg/mL):4mL(5.4.3)10mL

中用一级水定容至刻度临用现配

,。。

546内标混合标准工作液准确移取内标混合标准中间液至容

..(2.5μg/mL):1.25mL(5.4.4)5mL

量瓶中用一级水定容至刻度临用现配

,。。

2

GB/T46451—2025

6仪器和设备

61液相色谱串联三重四极杆质谱仪配有电喷雾离子源

.-:(ESI)。

62分析天平分度值

.:0.0001g。

63恒温水浴装置

.。

64离心机离心力g

.:(18000±500)。

65涡旋混匀器转速为

.:0r/min~2500r/min。

66超声波清洗仪

.。

67振荡研磨仪

.。

68移液器

.:1.0μL~10.0μL。

7分析步骤

71试样提取

.

711固体样本

..

称取约固体样本分别加入内标混合标准工作液磺基水杨酸

25mg,10μL2.5μg/mL、10μL10%

和甲酸水溶液后加入两颗钢珠放入振荡研磨仪研磨加入甲酸水溶液

180μL0.1%3min,300μL0.1%

涡旋混匀后超声以离心力为g的离心机在离心取上

15min,(18000±500)(6.4)4℃15min,50μL

清液待衍生

,。

712液体样本

..

准确移取液体样本使用移液枪加入内标混合标准工作液涡旋混

100μL,(6.7)10μL2.5μg/mL,

匀加入磺基水杨酸和甲酸水溶液涡旋混匀后超声以离心力为

,10μL10%380μL0.1%,15min,

g的离心机在离心取上清液待衍生

(18000±500)(6.4)4℃15min,50μL,。

72试剂衍生

.

精密吸取上述待衍生溶液置于离心管中加入衍生试剂溶

50μL(7.1)1.5mL,FDAA(3mg/mL)

液加入三乙胺溶液涡旋混匀盖紧管盖并采用封口膜密封置于水浴

100μL,50μL0.05mol/L,,,40℃

锅中反应取出后加入醋酸溶液乙腈水溶液涡旋混匀后以离心力

16h,50μL0.1mol/L,150μL10%,,

为g的离心机在离心取上清液转移至进样小瓶待测定

(18000±500)(6.4)4℃15min,。

73仪器参考条件

.

731液相条件如下

..:

色谱柱五氟苯基柱或相当者

a):(4.6×250mm,5μm),;

流动相乙腈和乙酸铵水溶液

):/;

b10mmolL

流速

c):0.5mL/min;

柱温

d):35℃±0.5℃;

进样量

e):1μL;

洗脱梯度见表

f)1。

3

GB/T46451—2025

表1超高效液相色谱洗脱梯度参考条件

时间流速流动相流动相

AB

minmL/min%%

0.0000.5009010

2.0000.5009010

20.0000.5005545

21.0000.5000100

23.0000.5000100

23.1000.5009010

27.0000.5009010

732质谱条件如下

..:

离子源电喷雾离子源

a):(ESI);

检测方式多反应监测

b):(MRM);

扫描方式负离子模式

c):;

毛细管电压负离子模式

d)::5500V;

离子源温度

e):350℃;

气帘气

f):206.84kPa;

喷雾气

g):275.79kPa;

辅助加热气

h):275.79kPa;

碰撞气

i):62.05kPa;

定量定性离子对等信息详见附录对手持氨基酸衍生物的多反应监测图详见附

j)B;26(MRM)

录

C。

74标准曲线的制作

.

用甲酸水溶液外标混合标准工作液内标混合标准工作

0.1%(5.2.2)、4μg/mL(5.4.5)、2.5μg/mL

液配制混合标准溶液工作曲线

(5.4.6):2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、

标准系列工作溶液中各内标的质量浓度为

100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。

配置完成后取标准溶液进行衍生步骤同

50ng/mL。50μL,7.2。

将衍生后标准系列工作液由低浓度到高浓度依次进样以对手性氨基酸与相应同位素内标的峰

,26

面积比值为纵坐标以标准系列工作液质量浓度为横坐标分别绘制对手性氨基酸的标准

,(ng/mL),26

曲线不同物质根据实际情况采用不同范围的标准曲线

。。

75定性和定量

.

751保留时间

..

被测试样中目标色谱峰与相应标准色谱峰的保留时间相比较相对误差应在之内

,±2.5%。

752离子丰度比

..

按照高效液相色谱串联质谱条件测定试样和标准工作溶液记录试样和标准溶液中各化合物的色

-,

谱保留时间以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度记录浓度相当的试样与标准

,,

4

GB/T46451—2025

工作溶液中相应成分的相对离子丰度

。

表2定性时离子丰度比的最大允许偏差

相对丰度K最大允许偏差

()/%/%

K

>50%±20

K

50%≥>20%±25

K

20%≥>10%±30

K

≤10%±50

753试样溶液的测定

..

将处理完毕的试样按仪器参考条件进行测定得到相应的样品溶液的色谱峰面积根

(7.2)(7.3),。

据标准曲线得到待测液中组分的浓度平行测定次数不少于两次

,。

8结果计算

81固态试样中各待测物含量按式计算

.(1):

ρV

X×