T/CSTE 0379-2023 生物活性肽的鉴别和细胞活性测定

ICS07.080

CCSA40

团体标准

T/CSTE0379—2023

生物活性肽的鉴别和细胞活性测定

IdentificationandCytoactivityDeterminationofBioactivePeptides

2023-08-15发布2023-09-01实施

中国技术经济学会发布

T/CSTE0379—2023

目次

前言.......................................................................................................................................................................III

1范围...................................................................................................................................................................1

2规范性引用文件..............................................................................................................................................1

3术语和定义......................................................................................................................................................1

4缩略语...............................................................................................................................................................1

5概述...................................................................................................................................................................1

6新建生物活性肽标准品的制备和标定..........................................................................................................1

7生物活性肽供试品的鉴别和细胞活性测定..................................................................................................3

附录A（资料性）生物活性肽（三肽-1）的纯度检测（HPLC法）.........................................................5

附录B（资料性）生物活性肽（三肽-1）分子量和氨基酸序列测定（LC-MS/MS法）........................7

附录C（资料性）生物活性肽（三肽-1）标准品细胞活性标定（细胞增殖法/MTT比色法）............11

附录D（资料性）生物活性肽（三肽-1）供试品细胞活性测定（细胞增殖法/MTT比色法）...........14

II

T/CSTE0379—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中国技术经济学会提出并归口。

本文件起草单位：珠海金肽生物科技有限公司、中国人民解放军总医院第七医学中心、珠海亿胜生

物制药有限公司、上海昊海生物科技股份有限公司、珠海市第三人民医院、浙江大学、广州先进技术研

究所。

本文件主要起草人：周守山、杨蓉娅、戴稳平、吴锐、林晓、郑赞顺、宋冠瑛、周庆玮、夏洁敏、

黄明星、李晓亮、姚之侃、王希。

本文件为首次发布。

III

T/CSTE0379—2023

生物活性肽的鉴别和细胞活性测定

1范围

本文件规定了生物活性肽的鉴别和细胞活性测定方法。

本文件适用于具有特定氨基酸序列且具有特定细胞活性的生物活性肽的鉴别和细胞活性测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T16631高效液相色谱法通则

GB/T38790.1生物活性肽的功效评价第一部分：总则

GB/T39100多肽抗氧化性测定DPPH法和ABTS法

GB/T39101多肽抗菌性测定抑菌圈法

中华人民共和国药典（2020年版）

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1生物活性肽bioactivepeptides，BAP

生物活性肽是对生物体的生命活动具有特定调控作用的肽类化合物。

3.2细胞活性cytoactivity

细胞活性是指生物活性肽对特定靶细胞的增殖、抑制和相关生理活动的调节能力。

3.3细胞活性单位cytoactiveunit，CU

本文件中，一个细胞活性单位对应为生物活性肽通过特定方法测定的EC50（µg/mL）值。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

EC50：半数有效浓度（HalfMaximalEffectiveConcentration）

HPLC：高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography）

LC-MS/MS：液相色谱串联质谱（LiquidChromatography--MassSpectrometry/MassSpectrometry）

5概述

本文件以生物活性肽标准品作为对照品，对生物活性肽供试品进行鉴别和细胞活性测定。生物活性

肽标准品应进行必要的分析鉴别，参照《中华人民共和国药典》（2020年版）三部生物制品国家标准物

质制备和标定的相关要求，对标准品的纯度、分子量、氨基酸序列、细胞活性等进行分析。

本文件附录根据相关规定，以三肽-1为实例，从生物活性肽的纯度检测、分子量测定、氨基酸序列

测定、新建生物活性肽标准品细胞活性标定和生物活性肽供试品细胞活性测定等方面，对本文件进行了

进一步说明。

6新建生物活性肽标准品的制备和标定

1

T/CSTE0379—2023

6.1新建生物活性肽标准品的要求

（1）纯度不低于95.0%；

（2）测定分子量与理论值差值在5ppm以内；

（3）氨基酸序列与理论序列一致。

6.2新建生物活性肽标准品的鉴别

6.2.1纯度确认

参照《中华人民共和国药典》（2020年版）四部通则0512高效液相色谱法进行检测，按面积归一化

法计算纯度，其结果应符合本文件6.1（1）要求。

6.2.2分子量确认

采用LC-MS/MS法进行检测，测定新建生物活性肽标准品分子量，其结果应符合本文件6.1（2）要

求。

6.2.3氨基酸序列确认

采用LC-MS/MS法进行检测，测定新建生物活性肽标准品氨基酸序列，其结果应符合本文件6.1（3）

要求。

6.3新建生物活性肽标准品的分装、冻干和包装

根据各种标准物质的要求进行配制、稀释，经质量检验合格后，精确分装，分装后立即进行冻干和

包装。

6.4新建生物活性肽标准品的检测项目

根据新建生物活性肽标准品的特性和使用目的，进行分装精度、水分、无菌、残留溶剂、炽灼残渣

检测和细胞活性标定，以及稳定性研究，并根据需要增加其他必要的检测项目。

6.4.1分装精度

按照《中华人民共和国药典》（2020年版）三部生物制品国家标准物质制备和标定的相关要求，精

确度应在±1%以内。

6.4.2水分

按照《中华人民共和国药典》（2020年版）四部通则0832水分测定法第一法（费休氏法）测定，结

果应不高于3%。

6.4.3无菌

按照《中华人民共和国药典》（2020年版）四部通则1101无菌检查法进行检测，结果需无菌。

6.4.4残留溶剂

按照《中华人民共和国药典》（2020年版）四部通则0861残留溶剂测定法进行检测，结果应符合该

方法所标示范围。

6.4.5炽灼残渣

按照《中华人民共和国药典》（2020年版）四部通则0841炽灼残渣检查法进行检测。

6.4.6细胞活性

按照本文件6.5进行细胞活性标定。

6.4.7稳定性研究

按照本文件6.6进行稳定性研究。

2

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6.5新建生物活性肽标准品的细胞活性标定

6.5.1标定方法

不同的生物活性肽具有不同的细胞活性测定方法，应参照相关标准或验证的方法进行相应的细胞活

性测定：

（1）具有促细胞增殖作用的生物活性肽，参照《中华人民共和国药典》（2020年版）四部通则3527

牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性测定法（细胞增殖法／MTT比色法）和3528人表皮生长因子生

物学活性测定法（细胞增殖法／MTT比色法），进行细胞活性测定；

（2）具有抗氧化活性的生物活性肽，按照GB/T39100，用DPPH法进行细胞活性测定；

（3）具有抑菌作用的生物活性肽，按照GB/T39101，用抑菌圈法进行细胞活性测定；

（4）具有其他功能的生物活性肽，可选用其他合适的细胞活性测定方法。

根据《中华人民共和国药典》（2020年版）四部通则1431生物检定统计法，以新建生物活性肽标准

品溶液浓度的自然对数值为横坐标，以增殖率、抑制率或清除率等为纵坐标，按照量反应平行线测定法

建立线性方程（R2＞0.9500），或四参数回归计算法建立逻辑斯蒂（logistic）方程（R2＞0.9800），计

算出EC50（µg/mL）。根据EC50值计算出新建生物活性肽标准品的CU值。

6.5.2协作标定

本文件中新建生物活性肽标准品的标定，一般需经至少3个具备相关检测能力的单位协作进行。参

加单位应采用统一的设计方案，标定结果须经统计学处理（标定结果至少需取得5次独立的有效结果）。

生物活性肽标准品CU值的确定，一般采用各协作单位标定结果的均值表示。

6.6新建生物活性肽标准品稳定性研究

参照《中华人民共和国药典》（2020年版）四部通则9402生物制品稳定性试验指导原则，根据标准

品性质放置不同温度（一般放置4℃、25℃、37℃、-20℃），不同时间，进行细胞活性的测定，以评

估其稳定情况。标准品建立以后，应定期核查其细胞活性是否变化。

6.7新建生物活性肽标准品的核定

（1）新建生物活性肽标准品由协作标定牵头单位对协作标定结果进行复核并认可。

（2）生物活性肽标准品替换批由协作标定牵头单位复核并认可。

（3）新建生物活性肽标准品经复核并认可后，即为生物活性肽标准品。

6.8生物活性肽标准品的标签和说明书

（1）符合规定的合格的生物活性肽标准品由协作标定牵头单位核发标签及说明书。

（2）生物活性肽标准品标签内容一般包括名称、编号、批号、装量、CU值、用途、存储条件和参

与协作标定的单位等信息。

（3）生物活性肽标准品应附有说明书。说明书除提供标签所标明的信息外，还应提供生物活性肽

标准品的组成和性状、使用方法、稳定性等信息，必要时应提供相关参考文献。

6.9生物活性肽标准品的使用发放和保管

（1）生物活性肽标准品适用性由使用者根据使用目的自行确认。

（2）生物活性肽标准品应贮存于适宜的温度、湿度等条件下，其保存条件需定期检查并记录。

（3）生物活性肽标准品由专人保管和登记发放。

7生物活性肽供试品的鉴别和细胞活性测定

7.1生物活性肽供试品鉴别

7.1.1检测

选取与供试品对应的生物活性肽标准品作为对照品，参照《中华人民共和国药典》（2020年版）四

部通则0512高效液相色谱法进行检测。

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7.1.2鉴别

结果判定：以保留时间和色谱峰进行鉴别，供试品应与标准品一致。

7.2生物活性肽供试品的细胞活性测定

7.2.1生物活性肽标准品溶液的制备

取生物活性肽标准品，按说明书复溶后，预稀释至40CU/mL，再稀释到不同倍数，得到不同浓度

的生物活性肽标准品溶液。其中预稀释倍数表示为Dr。

7.2.2生物活性肽供试品溶液的制备

取生物活性肽供试品，按标示量复溶后，预稀释至约40CU/mL，再稀释到不同倍数，得到不同浓

度的生物活性肽供试品溶液。其中预稀释倍数表示为Ds。

7.2.3生物活性肽供试品活性测定

以生物活性肽标准品为对照，参照相关标准或验证的方法（方法选择同本文件6.5.1），对不同生物

活性肽供试品进行细胞活性测定，得出不同稀释倍数对应的增殖率、抑制率或清除率等。

根据《中华人民共和国药典》（2020年版）四部通则1431生物检定统计法，分别以生物活性肽标准

品和生物活性肽供试品溶液稀释倍数倒数的自然对数值为横坐标，以增殖率、抑制率或清除率等为纵坐

标，按照量反应平行线测定法建立线性方程（R2＞0.9500），或四参数回归计算法建立逻辑斯蒂（logistic）

2

方程（R＞0.9800）。根据方程计算出标准品1CU/ml的稀释倍数Er和供试品相当于标准品1CU/ml的稀

释倍数Es。

7.2.4生物活性肽供试品细胞活性结果计算

按式（1）计算：

······················································(1)

����

式中：

��=������

Ps—为生物活性肽供试品CU值；

Pr—为生物活性肽标准品CU值；

Ds—为生物活性肽供试品预稀释倍数；

Dr—为生物活性肽标准品预稀释倍数；

Es—为生物活性肽供试品相当于生物活性肽标准品1CU/ml的稀释倍数；

Er—为生物活性肽标准品1CU/ml的稀释倍数。

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A

A

附录A

（资料性）

生物活性肽（三肽-1）的纯度检测（HPLC法）

三肽-1是具有促细胞增殖活性的生物活性肽，其氨基酸序列为甘氨酸-组氨酸-赖氨酸（Gly-His-Lys），

分子量340.38Da，CAS编号为49557-75-7。本附录用HPLC法对三肽-1的纯度进行检测。

A.1试剂及配制

试验用水为GB/T6682-2008规定的一级水。

准确称取三肽-1，配制成溶液，浓度范围（0.05-1.00mg/mL）。

A.1.1三氟乙酸

色谱纯。

A.1.2乙腈

色谱纯。

A.2仪器

A.2.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器。

A.2.2分析天平：感量为0.0001g。

A.2.3涡旋混合器。

A.2.4超声波清洗器：功率≥500W。

A.2.5恒温水浴锅：控温精度±1℃。

A.2.6精密移液器：0.5～10µL，10～100µL，100～1000µL。

A.3色谱条件

以下HPLC操作条件是典型操作参数，可根据不同仪器的特点，对操作参数作适当调整，以获得最

佳效果。

（1）色谱条件

流动相：流动相A：0.1%三氟乙酸-水溶液；流动相B：0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；

流速：1mL/min；

柱温：25～30℃；

进样量：10～30μL；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱[粒径5μm，4.6mm×250mm]；

建议梯度洗脱，根据不同仪器和样品优化洗脱条件。

（2）检测条件要求

理论塔板数：＞4000；

线性R2值：≥0.99；

加标回收率：80%～120%；

精密度：样品溶液连续进样6次，测定其峰面积，计算峰面积相对标准偏差(relativestandarddeviation,

RSD)。RSD可接受范围参考《中华人民共和国药典》（2020年版）四部通则9101分析方法验证指导原

则中，表3（样品中待测成分的含量与精密度可接受范围关系）的数据要求。

A.4测试

将三肽-1溶液注入液相色谱仪中，以保留时间和色谱峰进行定性，测得三肽-1的色谱峰面积（或峰

高）占比。

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A.5结果计算

根据面积归一化法计算三肽-1纯度。三肽-1溶液色谱图见图A.1，检测波长214nm。三肽-1的峰面积

（峰高）占比见表A.1，纯度为98.865%。

图A.1三肽-1溶液色谱图

表A.1三肽-1溶液色谱图保留时间、峰面积、峰高