DB37/T 2038-2012 牛尿苷酸合酶缺乏症（DUMPS）分子检测技术规程

ICS65.020.30

B41

DB37

山东省地方标准

DB37/T2038—2012

牛尿苷酸合酶缺乏症（DUMPS）分子检测

技术规程

Technicalspecificationofdetectionfordeficiencyofuridinemonophophatesynthase

inbovine

2012-02-09发布2012-03-01实施

山东省质量技术监督局发布

DB37/T2038—2012

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由山东省畜牧兽医局提出。

本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公

司。

本标准主要起草人：李荣岭、张思聪、王洪梅、李秋玲、李建斌、黄金明、鞠志花、王长法、侯明

海、曲绪仙、仲跻峰。

I

DB37/T2038—2012

牛尿苷酸合酶缺乏症（DUMPS）分子检测技术规程

1范围

本标准规定了牛DUMPS分子检测的技术方法。

本标准适用于牛DUMPS分子检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

NY/T1672-2008绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程

SN/T1193基因检验实验室技术要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

尿苷酸合酶缺乏症deficiencyofuridinemonophophatesynthase

尿甘酸合酶缺乏症是由于牛体内尿苷酸合酶（UridineMonophophateSynthase，UMPS）基因的C-

末端405处的密码子存在一个点突变，使编码精氨酸的密码子CGA转变为终止密码子UGA引起。

3.2

限制性内切酶restrictionendonuclease

限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。

3.3

限制性片段长度多态性restrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP)

限制性片段长度多态性是根据基因组上限制性内切酶切位点核苷酸发生突变，或酶切位点之间发生

核苷酸的插入、缺失而导致酶切片段长度发生变化，对基因突变进行检测的一种方法。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

1

DB37/T2038—2012

dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）

bp：碱基对（basepair）

5检测原理

尿甘酸合酶缺乏症是由于奶牛体内尿苷酸合酶（UMPS）基因的C-末端405处的密码子存在一个点突

变（碱基1→碱基2），使编码精氨酸的密码子CGA转变为终止密码子的UGA，导致含有纯合突变基因型的

胚胎早期死亡。基于这个点突变设计引物对该区域进行PCR扩增以及RFLP分析，由于野生型与突变型个

体的基因片段的长度存在显著差异，因而，通过PCR-RFLP分析会在聚丙烯酰胺凝胶上产生不同的带型，

可根据奶牛个体在凝胶中呈现带型的不同来判断被检测个体的基因型。

6主要试剂

除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-2008的双蒸水；高压灭菌条件为1.034×

105Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂及配制方法见附录A。

7主要仪器设备

主要仪器设备见附录B。

8检测方法

8.1样本采集

静脉采集血样3～5mL，ACD抗凝，-20℃保存。公牛可用2～3剂细管精液，-196℃保存。

8.2基因组DNA提取

8.2.1血样中DNA的提取

提取方法见附录C。

8.2.2精液中DNA的提取

提取方法见附录D。

8.3基因组DNA检测

具体按照NY/T1672-2008的规定执行。

8.4引物的设计与合成

上游引物：5'-GAACATTCTGAATTTGTGATTGGT-3'；

下游引物：5'-GCTTCTAACTGAACTCCTCGAGT-3'。

扩增产物大小为95bp。

8.5PCR扩增

8.5.1PCR扩增体系

2

DB37/T2038—2012

PCR扩增反应总体积为20μL，其中10×PCRBuffer(含15mmol/L的Mg2+)2.0μL，10mmol/LdNTPs

0.5μL，10pmol/μL的上、下游引物各0.5μL，TaqDNA聚合酶1U，DNA模板100ng，加双蒸水至20

μL。

8.5.2PCR扩增循环参数

PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终

延伸5min，4℃保存。

8.5.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测

琼脂糖凝胶制备需要胶板、隔板、微波炉、三角瓶和多齿梳子、一次性手套等。先用水清洗制胶板，

再用1×TAE冲洗一次