GB/T 31796-2015 南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆猝死综合症病菌检疫鉴定方法

ICS65.020.010

B16

中华人民共和国国家标准

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GBT317962015

南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆

猝死综合症病菌检疫鉴定方法

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DetectionandidentificationofFusariumtucumaniaeand

Fusariumviruliorme

gf

2015-07-03发布2015-11-27实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

/—

GBT317962015

前言

本标准按照/—给出的规则起草。

GBT1.12009

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Ⅰ

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GBT317962015

南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆

猝死综合症病菌检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆猝死综合症病菌的检疫鉴定方法。

、。

本标准适用于田间大豆和大豆粒携带的土壤和病残体中南北美大豆猝死综合症病菌的鉴定

2仪器和用具

2.1仪器

、、、(/)、、、、

生物显微镜超净工作台光照培养箱电子天平11000g高压灭菌锅冰箱PCR扩增仪荧光

、、、、、。

PCR扩增仪电泳仪凝胶成像仪高速冷冻离心机恒温水浴锅摇床

2.2用具

、、、、、、、、、、、、、

烧杯三角瓶量筒试管培养皿酒精灯镊子剪刀解剖刀接种针载玻片盖玻片塑料研杵

、、、。

移液器移液器吸头离心管液氮罐

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3试剂和培养基

3.1试剂

,,,,,,,,,,,

琼脂粉马铃薯葡萄糖乳酸琼脂糖无菌双蒸水液氮蛋白胨磷酸二氢钾硫酸镁链霉素新

,,,,,,,,,,,,

霉素五氯硝基苯氯四环素利福平is

Tris-HClMClHClEDTANaOHNaOAcKClTr

g2

,,(),(),(),(),

CTABTAE无水乙醇Ethanol苯酚Phenol溴化乙锭EB三氯甲烷Chloroform异丙醇

(),(),,,,

Isoroanol异戊醇Isoamlalcohol蛋白酶KTaDNA聚合酶dNTPDNA相对分子质量标准

ppyq

,//,/

物双重特异性引物和实时荧光特异性引物及探针和

PCRFu12Fs-α-12PCR16-FP16-RP

g

,。

16-AGTaManUniversalPCRMasterMix

q

3.2培养基

,,(),

0.2%水琼脂培养液选择性培养基PCNB马铃薯葡萄糖培养基PDA低营养合成培养基

()。具体配方参见附录。

SNAA

4检疫鉴定方法

4.1症状检查

、,,

南北美大豆猝死综合症在症状上区别不大病害典型的症状是叶片的叶肉枯黄坏死叶脉有时保

,,。。

持绿色根部维管束组织有褐色病变髓部白色参见附录病害症状描述

A

、,。,

采集田间疑似症状大豆植株的根部植株周围的土壤备用在大豆粒中筛选其携带的土壤并挑

,,。

选其中混杂的病残体尤其是大豆的地下部分根备用

1

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GBT317962015

4.2分离培养

,、,

将土壤样品每份取2g放入100mL0.2%的水琼脂培养液中摇床摇动混匀20min用无菌水将

,。

培养液分别稀释倍和倍分别取土壤稀释液涂抹于选择性培养基平板上每处理

10201mLPCNB

个重复,光照培养,后观察菌落的产生情况。

523℃4d~7d

,,

将病残体切取边长为5mm~10mm的见方小块70%乙醇表面消毒10s~30s放置在选择性培

养基上,光照/黑暗培养周周。

PCNB20℃12h12h1~2

4.3形态学鉴定

,,/

如在选择性培养基上观察到真菌菌落的形成转接到上光照黑暗或

PCNBPDA20℃12h12h

,,

自然光线下培养3d~5d后开始观察记录病菌的培养性状显微镜下观察记录分生孢子的形状和

大小。

,,

如上有疑似菌落出现转到上黑暗培养显微镜下观察记录分生孢子的形状和

PDASNA20℃

大小。

4.4分子生物学检测

4.4.1DNA提取

,,。

收集分离到的真菌菌丝采用CTAB方法提取DNA参见附录B

4.4.2双重PCR检测

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北美大豆猝死综合症病菌()的双重特异性引物为::

FusariumviruliormePCRFu15'-GGAGGG

gf

,:,:

ATCATTACCGAGTT-3'Fu25'-TTCCAGTTGCGAGGTGTTA-3'Fs-α-15'-AGTCGACCACCGTAAG

g

,:。

TCG-3'Fs-α-25'-GATCAGGGCTTTGTCCAAC-3'

g

反应体系():缓冲液,/,/,

25L10×PCR3L25mmolLMCl2L10mmolLdNTP0.5L

μμg2μμ

//引物各,//引物各,,

10molLFu120.8L10molLFs-α-121.0LTaDNA聚合酶1U模板

μμμgμq

,。

DNA4ng加灭菌双蒸水至25L

μ

:,,(,;,;),

反应条件变性处理后经个循环延伸

94℃5min3094℃1min55℃30s72℃30s72℃

10min。

,,。

1.2%琼脂糖凝胶电泳EB染色凝胶成像系统观察电泳结果

4.4.3荧光PCR检测

南美大豆猝死综合症病菌(Fusariumtucumaniae)荧光PCR引物及探针序列为:16-FP:

,:,:

CCAGTGGTGCGGAAGGTA16-RPGACGGCGATTCCAACAGTAG16-AGJUP-ACCCTAGAG

CTCGTCTT-JUP。

():,

反应体系10L实时荧光反应混合液5LTaManUniversalPCRMasterMix0.3L各引物

μμqμ

(/),(/),(/),。,

10molL0.3L探针10molL1LDNA10nL无菌双蒸水3.1L将反应体系混匀

μμμμgμμ

,。,

离心后置于实时荧光仪中进行反应每个反应重复次以无菌双蒸水作空白对照阳性对照以

PCR2

,。

南美大豆猝死病菌DNA为模板阴性对照以大豆上其他镰刀菌DNA为模板

,,:变性,延伸

反应条件为50℃预热2min95℃变性10min然后进入循环反应95℃15s60℃

,。

共次循环

1min40

2

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GBT317962015

5鉴定特征

5.1培养性状

、。

南北美大豆猝死综合症病菌在菌落培养形状上区别不大

、。

南北美大豆猝死综合症病菌的菌落在选择性培养基上可显现特征是生长速度

PCNB4d~7d

,,;,;、

较缓慢直径小一般为0.5cm~0.9cm颜色为白色中心有时为浅黄色突起形状为圆形星型或放射

;,,,。

状菌落微隆表面为粉笔末的颗粒状较致密无气生菌丝覆盖

、、、,,

南北美大豆猝死综合症病菌在PDA上菌落通常为蓝绿色灰绿色浅绿色或蓝色偶尔黄白色

,。,。

菌落边缘为灰白色缺乏气生菌丝随着菌落的年龄增长颜色由蓝绿色变化为蓝紫色或深绿色

5.2病菌形态

南美大豆猝死综合症病菌()(),

F.tucumaniae菌丝在SNA上宽1m~5m~14m厚垣孢子形

μμμ

,,,、,、,

成在菌丝和分生孢子上通常在末端偶尔在中间形成亚球型单个无色至白色黄灰或白黄外表光

,,()()。

滑至粗糙有时有小疣大小8m~20m×10m~20mF.tucumaniae在荧光或自然光培养

μμμμ

,,,。

的上菌落蓝绿色黑暗条件下为浅色产孢快速且丰富和上的分生孢子座都很丰

PDASNAPDA

,。,,,

富但PDA上很少有菌丝链气生的分生孢子梗在SNA上丰盛通常无分枝或零星分枝长230m

μ

,,。,

宽2m~2.5m形成单瓶梗粘在顶部气生瓶梗钻型到近圆柱型气生分生孢子有两种类型第一种

μμ

,,,,

是弯柱状到镰刀形2~5隔膜有足细胞与镰刀形的分生孢子座的分生孢子形态区分明显主要形成

;、、,()(

在较高的分生孢子梗上第二种分生孢子微小卵圆0~1分隔大小范围4.5m~13m×2m~

μμμ

),()(国家标准ㅤ可打印ㅤ可复制ㅤ无水印ㅤ高清原版ㅤ去除空白页),,、

3.5m平均6.6m~7.7m×2.4m~2.7m在菌落的一小部分上形成长在高50m宽

μμμμμμ

2m~3m的短分生孢子梗上。

μμ

,,

F.tucumaniae分生孢子座的分生孢子梗轮状分枝或很少分枝顶部生成单瓶梗分生孢子座瓶梗

、、,。、,

简单钻形安锫瓶形顶端通常有个显著的囊领分生孢子座的分生孢子通常圆柱形微弯有时镰刀

,,,()()。

形背部和腹部线条接近平行有尖锐的顶部细胞和明显的足细胞隔膜上隔

2~3~4~6SNA3

()(),()

膜大型分生孢子大小范围为38m~72.5m×4m~6.5m平均52.2m~63.3m×

μμμμμμ

(),,()(),(

4.7m~4.9m在PDA上大小范围34.5m~71m×4m~5.5m平均55.0m~

μμμμμμμ

)(),上隔膜大型分生孢子大小范围为()(

58.3m×4.7m~4.9mSNA450.5m~81m×4m~

μμμ