DB51/T 1836-2014 牦牛源沙门氏菌分离鉴定技术规范

ICS65.020.30

B41

DB51

四川省地方标准

DB51/T1836—2014

牦牛源沙门氏菌分离鉴定技术规范

2014-09-19发布2014-10-01实施

四川省质量技术监督局发布

DB51/T1836—2014

目次

前言...............................................................................II

1范围..............................................................................1

2规范性引用文件....................................................................1

3术语和定义........................................................................1

4设备和试剂........................................................................2

5分离培养..........................................................................3

6生化试验..........................................................................4

7PCR鉴定...........................................................................4

8报告结果的表示....................................................................5

9废弃物无害化处理..................................................................5

附录A（规范性附录）相关试剂配制....................................................6

I

DB51/T1836—2014

前言

本标准附录A为规范性附录。

本标准由四川省农业厅提出并归口。

本标准由四川省质量技术监督局批准发布。

本标准起草单位：西南民族大学。

本标准主要起草人：张焕容、汤承、岳华、杨发龙、王永、张斌、任玉鹏、王远微。

II

DB51/T1836—2014

牦牛源沙门氏菌分离鉴定技术规范

1范围

本标准规定了牦牛源沙门氏菌的分离鉴定方法。

本标准适用于牦牛源沙门氏菌的分离及鉴定和牦牛沙门氏菌病的诊断。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。

GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程。

《兽医实验室生物安全技术管理规范》（2003农业部公告第302号）。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

沙门氏菌属salmonella

是一群寄生于人和动物肠道内的革兰阴性杆菌，生化特性和抗原结构相似，兼性厌氧。绝大多数发

酵葡萄糖产酸产气，也偶尔有不产气的。在三糖铁琼脂上常产生H2S。

3.2

牦牛源沙门氏菌salmonellainYak

是指从牦牛实质器官、粪便和肉品中分离鉴定的沙门氏菌，包括致病性和非致病性沙门氏菌。致病

性沙门氏菌常引起犊牦牛副伤寒，犊牦牛或青年牦牛急性胃肠炎和败血症及其他组织局部炎症。且为人

类食物中毒的主要病原之一。

4设备和试剂

4.1主要仪器设备

4.1.1CO2培养箱

4.1.2移液器(0.1μL~10μL、2μL~20μL、20μL~200μL、200μL~1000μL)。

4.1.3离心机

4.1.4无菌工作台

1

DB51/T1836—2014

4.1.54PCR扩增仪

4.1.6电泳仪、水平电泳槽

4.2培养基和试剂(见附录A)

4.2.1缓冲蛋白胨水(BPW)

4.2.2四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液

4.2.3木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂

4.2.4SS培养基

4.2.5麦康凯培养基(MaCC)

4.2.6三糖铁(TSI)琼脂

4.2.7赖氨酸脱羧酶试验培养基

4.3PCR鉴定相关试剂

4.3.1引物（10μmol/L）

上游引物：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’

下游引物：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’。

4.3.2扩增目的片段大小为284bp。

4.3.3DNA提取试剂：蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（SDS）、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙

醇。

4.3.4PCR反应试剂：TaqDNA聚合酶（5U/μL）、MgCl2（25mmol/L）、dNTP（每种浓度为2.5

mmol/L）、10×PCRBuffer(无Mg2+)。

4.3.5STE缓冲液(见附录A)

4.3.6TAE电泳缓冲液(见附录A)

4.3.76×上样缓冲液(6×LoadingBuffer)

4.3.8琼脂糖(电泳级)

4.3.9核酸染料(Goldview)

4.3.10DNA分子量标准DL600。

4.3.11水：所用水应符合GB/T6682中三级水（三蒸水）规格。

4.3.12阳性对照：标准参考毒株作为阳性对照。

4.3.13阴性对照：用GB/T6682中三级水代替PCR扩增模板作为阴性对照。

5分离培养

5.1样品的采集

无菌采取牦牛粪便、肉品或实质器官棉拭子。

5.2预增菌

把采集的棉拭子置于10mLBPW增菌液于36℃±1℃培养8h～18h。

5.3增菌

取1mL预增菌液转种于10mLTTB增菌液内，于42℃±1℃培养18h～24h。

2

DB51/T1836—2014

5.4分离培养

分别用接种环取增菌液1环，划线接种于SS琼脂平板和XLD平板于36℃±1℃培养18h～24

h观察各个平板上生长的菌落,挑取SS平板上灰白色、半透明、圆珠状、边缘整齐、光滑湿润、中心

黑色，中等大小的菌落3～5个或透明，针尖大小的菌落，和XLD平板上呈粉红色，带或不带黑色中

心的菌落3～5个