基本信息
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发布历史
-
2015年02月
研制信息
- 起草单位:
- 中国科学院西北高原生物研究所
- 起草人:
- 窦全文、雷云霆、王海庆、汪新川、喻凤、李媛、赵闫闫、陈志国、刘德梅
- 出版信息:
- 页数:11页 | 字数:- | 开本: -
内容描述
ICS65.020.20
B21
备案号:44859-2015DB63
青海省地方标准
DB63/T1360—2015
青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定技
术规程
2015-02-09发布2015-03-15实施
青海省质量技术监督局发布
DB63/T1360—2015
前言
本规程按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
本规程由中国科学院西北高原生物研究所提出并归口。
本规程负责起草单位:中国科学院西北高原生物研究所
本规程主要起草人:窦全文、雷云霆、王海庆、汪新川、喻凤、李媛、赵闫闫、陈志国、刘德梅、
杨文韬。
I
DB63/T1360—2015
青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定技术规程
1范围
本规程规定了青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定的设备、试剂配制、操作程序、SSR引物以及判定原
则等技术内容。
本标准适用于种子管理部门、农业科研、教学、生产、农技推广等单位对多年生牧草品种青牧1号
老芒麦真实性及纯度的鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的应用文件,仅所注日期的版本适用于本文
件。凡是不注明日期的应用文件,其最新版本(包括所有地修改单)适用于本文件。
GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样
3仪器、设备与试剂
仪器、设备与试剂见附录A
4试剂配制
4.1DNA提取试剂
4.1.1乙二胺四乙酸二钠盐溶液
称取EDTA-Na2·2H2O9.306g,加去离子水35mL,剧烈搅拌,用NaOH颗粒0.8g~1.11g调pH至8.0,
定容至50mL,终浓度为0.5mol/L。
4.1.2三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液
称取Tris6.06g,加超纯水40mL溶解,滴加浓HCl1.8mL~2.2mL调pH至8.0,定容至50ml,终
浓度为0.5mol/L。
4.1.3DNA提取液
称取十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)8g,氯化钠32.7g,三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液10mL,乙二
胺四乙酸二钠盐溶液4mL,混合,再用去离子水定容至400mL。
4.1.4三氯甲烷和异戊醇混合液(24:1)
量取三氯甲烷240mL和异戊醇10mL,混匀。
4.1.570%乙醇
1
DB63/T1360—2015
取无水乙醇70mL加入到30mL去离子水中,混匀。
4.1.610倍DNA溶解液
三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液10mL,乙二胺四乙酸二钠盐溶液2mL,先加入去离子水50mL,溶
解混合均匀,再定容至100mL,高温高压灭菌,室温保存。
4.1.71倍DNA溶解液
取10倍DNA溶解液10mL,加入90mL去离子水,混匀。
4.2PCR扩增试剂
4.2.1四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs:dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合溶液
取浓度为100mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP储存液各25μL混合,加入去离子水900μL,
配成终浓度为2.5mmol/L工作液。-20℃条件下保存。
4.2.2引物稀释
用去离子水配制引物浓度为100μM的储存液,取10μL储存液加人90μL去离子水配成10μM工
作液。
4.3聚丙烯酰胺凝胶试剂
4.3.15倍电泳缓冲液
分别称取Tris54g,硼酸27.5g,放于1000mL烧杯中,加入蒸馏水800mL,充分搅拌溶解,
再加入乙二胺四乙酸二钠盐溶液20mL,混匀,定容至1000mL。
4.3.230%聚丙烯酰胺
分别称取丙烯酰胺29g和甲叉双丙烯酰胺1g,并放于100mL烧杯中,加入约蒸馏水80mL,充分
搅拌,定容至100mL,用滤纸过滤,于棕色瓶中4℃保存。
4.3.310%过硫酸铵
称取过硫酸铵100mg,并放于1.5mL离心管中。加入蒸馏水1mL,充分震荡,于4℃冰箱保存。
(保存期7d)
4.3.41倍电泳缓冲液
取5倍电泳缓冲液500mL,加去离子水2000mL,混匀。
4.3.5加样缓冲液
称量EDTA440mg,溴酚蓝25mg,二甲苯青25mg,置于500mL烧杯中,向烧杯中加入去离子水20
mL,加热搅拌充分溶解,加入甘油18mL后,使用NaOH调节PH值至7.0,用去离子水定容至50mL,室温
保存。
4.4染色试剂
4.4.110mg/mL溴化乙锭
2
DB63/T1360—2015
称量溴化乙锭0.5g,加入到50ml容器中,加入去离子水50ml,充分搅拌数小时完全溶解溴化乙
锭,将溶液转移至棕色瓶中,室温避光保存。
4.4.2凝胶染色液
取10mg/mL溴化乙锭溶液10μL,加入400mL的去离子水,混匀。
5引物
从老芒麦基因组中克隆和鉴定得到的SSR引物见附录B。
6操作步骤
6.1试样制备
青牧1号老芒麦种子单粒发芽成苗。
6.2DNA提取
DNA提取步骤如下:
a)将DNA提取液在65℃水浴中预热。
b)剪取长度为5cm种子幼苗,置于2.0mL的离心管中,加
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