DB63/T 1360-2015 青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定技术规程

DB63/T 1360-2015

青海省地方标准 简体中文 废止 页数:11页 | 格式:PDF

基本信息

标准号
DB63/T 1360-2015
标准类型
青海省地方标准
标准状态
废止
中国标准分类号(CCS)
国际标准分类号(ICS)
发布日期
2015-02-09
实施日期
2015-03-15
发布单位/组织
青海省质量技术监督局
归口单位
中国科学院西北高原生物研究所
适用范围
本规程规定了青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定的设备、试剂配制、操作程序、SSR引物以及判定原则等技术内容。本标准适用于种子管理部门、农业科研、教学、生产、农技推广等单位对多年生牧草品种青牧1号老芒麦真实性及纯度的鉴定。
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发布历史

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研制信息

起草单位:
中国科学院西北高原生物研究所
起草人:
窦全文、雷云霆、王海庆、汪新川、喻凤、李媛、赵闫闫、陈志国、刘德梅
出版信息:
页数:11页 | 字数:- | 开本: -

内容描述

ICS65.020.20

B21

备案号:44859-2015DB63

青海省地方标准

DB63/T1360—2015

青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定技

术规程

2015-02-09发布2015-03-15实施

青海省质量技术监督局发布

DB63/T1360—2015

前言

本规程按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本规程由中国科学院西北高原生物研究所提出并归口。

本规程负责起草单位:中国科学院西北高原生物研究所

本规程主要起草人:窦全文、雷云霆、王海庆、汪新川、喻凤、李媛、赵闫闫、陈志国、刘德梅、

杨文韬。

I

DB63/T1360—2015

青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定技术规程

1范围

本规程规定了青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定的设备、试剂配制、操作程序、SSR引物以及判定原

则等技术内容。

本标准适用于种子管理部门、农业科研、教学、生产、农技推广等单位对多年生牧草品种青牧1号

老芒麦真实性及纯度的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的应用文件,仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注明日期的应用文件,其最新版本(包括所有地修改单)适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

3仪器、设备与试剂

仪器、设备与试剂见附录A

4试剂配制

4.1DNA提取试剂

4.1.1乙二胺四乙酸二钠盐溶液

称取EDTA-Na2·2H2O9.306g,加去离子水35mL,剧烈搅拌,用NaOH颗粒0.8g~1.11g调pH至8.0,

定容至50mL,终浓度为0.5mol/L。

4.1.2三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液

称取Tris6.06g,加超纯水40mL溶解,滴加浓HCl1.8mL~2.2mL调pH至8.0,定容至50ml,终

浓度为0.5mol/L。

4.1.3DNA提取液

称取十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)8g,氯化钠32.7g,三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液10mL,乙二

胺四乙酸二钠盐溶液4mL,混合,再用去离子水定容至400mL。

4.1.4三氯甲烷和异戊醇混合液(24:1)

量取三氯甲烷240mL和异戊醇10mL,混匀。

4.1.570%乙醇

1

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取无水乙醇70mL加入到30mL去离子水中,混匀。

4.1.610倍DNA溶解液

三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液10mL,乙二胺四乙酸二钠盐溶液2mL,先加入去离子水50mL,溶

解混合均匀,再定容至100mL,高温高压灭菌,室温保存。

4.1.71倍DNA溶解液

取10倍DNA溶解液10mL,加入90mL去离子水,混匀。

4.2PCR扩增试剂

4.2.1四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs:dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合溶液

取浓度为100mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP储存液各25μL混合,加入去离子水900μL,

配成终浓度为2.5mmol/L工作液。-20℃条件下保存。

4.2.2引物稀释

用去离子水配制引物浓度为100μM的储存液,取10μL储存液加人90μL去离子水配成10μM工

作液。

4.3聚丙烯酰胺凝胶试剂

4.3.15倍电泳缓冲液

分别称取Tris54g,硼酸27.5g,放于1000mL烧杯中,加入蒸馏水800mL,充分搅拌溶解,

再加入乙二胺四乙酸二钠盐溶液20mL,混匀,定容至1000mL。

4.3.230%聚丙烯酰胺

分别称取丙烯酰胺29g和甲叉双丙烯酰胺1g,并放于100mL烧杯中,加入约蒸馏水80mL,充分

搅拌,定容至100mL,用滤纸过滤,于棕色瓶中4℃保存。

4.3.310%过硫酸铵

称取过硫酸铵100mg,并放于1.5mL离心管中。加入蒸馏水1mL,充分震荡,于4℃冰箱保存。

(保存期7d)

4.3.41倍电泳缓冲液

取5倍电泳缓冲液500mL,加去离子水2000mL,混匀。

4.3.5加样缓冲液

称量EDTA440mg,溴酚蓝25mg,二甲苯青25mg,置于500mL烧杯中,向烧杯中加入去离子水20

mL,加热搅拌充分溶解,加入甘油18mL后,使用NaOH调节PH值至7.0,用去离子水定容至50mL,室温

保存。

4.4染色试剂

4.4.110mg/mL溴化乙锭

2

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称量溴化乙锭0.5g,加入到50ml容器中,加入去离子水50ml,充分搅拌数小时完全溶解溴化乙

锭,将溶液转移至棕色瓶中,室温避光保存。

4.4.2凝胶染色液

取10mg/mL溴化乙锭溶液10μL,加入400mL的去离子水,混匀。

5引物

从老芒麦基因组中克隆和鉴定得到的SSR引物见附录B。

6操作步骤

6.1试样制备

青牧1号老芒麦种子单粒发芽成苗。

6.2DNA提取

DNA提取步骤如下:

a)将DNA提取液在65℃水浴中预热。

b)剪取长度为5cm种子幼苗,置于2.0mL的离心管中,加

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