DB63/T 1360-2015 青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定技术规程

ICS65.020.20

B21

备案号：44859-2015DB63

青海省地方标准

DB63/T1360—2015

青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定技

术规程

2015-02-09发布2015-03-15实施

青海省质量技术监督局发布

DB63/T1360—2015

前言

本规程按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本规程由中国科学院西北高原生物研究所提出并归口。

本规程负责起草单位：中国科学院西北高原生物研究所

本规程主要起草人：窦全文、雷云霆、王海庆、汪新川、喻凤、李媛、赵闫闫、陈志国、刘德梅、

杨文韬。

I

DB63/T1360—2015

青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定技术规程

1范围

本规程规定了青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定的设备、试剂配制、操作程序、SSR引物以及判定原

则等技术内容。

本标准适用于种子管理部门、农业科研、教学、生产、农技推广等单位对多年生牧草品种青牧1号

老芒麦真实性及纯度的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注明日期的应用文件，其最新版本（包括所有地修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

3仪器、设备与试剂

仪器、设备与试剂见附录A

4试剂配制

4.1DNA提取试剂

4.1.1乙二胺四乙酸二钠盐溶液

称取EDTA-Na2·2H2O9.306g，加去离子水35mL，剧烈搅拌，用NaOH颗粒0.8g～1.11g调pH至8.0，

定容至50mL，终浓度为0.5mol/L。

4.1.2三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液

称取Tris6.06g，加超纯水40mL溶解，滴加浓HCl1.8mL～2.2mL调pH至8.0，定容至50ml，终

浓度为0.5mol/L。

4.1.3DNA提取液

称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）8g，氯化钠32.7g，三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液10mL，乙二

胺四乙酸二钠盐溶液4mL，混合，再用去离子水定容至400mL。

4.1.4三氯甲烷和异戊醇混合液（24：1）

量取三氯甲烷240mL和异戊醇10mL，混匀。

4.1.570%乙醇

1

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取无水乙醇70mL加入到30mL去离子水中，混匀。

4.1.610倍DNA溶解液

三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液10mL，乙二胺四乙酸二钠盐溶液2mL，先加入去离子水50mL，溶

解混合均匀，再定容至100mL，高温高压灭菌，室温保存。

4.1.71倍DNA溶解液

取10倍DNA溶解液10mL，加入90mL去离子水，混匀。

4.2PCR扩增试剂

4.2.1四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs：dATP、dCTP、dGTP、dTTP）混合溶液

取浓度为100mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP储存液各25μL混合，加入去离子水900μL，

配成终浓度为2.5mmol/L工作液。-20℃条件下保存。

4.2.2引物稀释

用去离子水配制引物浓度为100μM的储存液，取10μL储存液加人90μL去离子水配成10μM工

作液。

4.3聚丙烯酰胺凝胶试剂

4.3.15倍电泳缓冲液

分别称取Tris54g，硼酸27.5g，放于1000mL烧杯中，加入蒸馏水800mL，充分搅拌溶解，

再加入乙二胺四乙酸二钠盐溶液20mL，混匀，定容至1000mL。

4.3.230%聚丙烯酰胺

分别称取丙烯酰胺29g和甲叉双丙烯酰胺1g，并放于100mL烧杯中，加入约蒸馏水80mL，充分

搅拌，定容至100mL，用滤纸过滤，于棕色瓶中4℃保存。

4.3.310%过硫酸铵

称取过硫酸铵100mg，并放于1.5mL离心管中。加入蒸馏水1mL，充分震荡，于4℃冰箱保存。

（保存期7d）

4.3.41倍电泳缓冲液

取5倍电泳缓冲液500mL，加去离子水2000mL，混匀。

4.3.5加样缓冲液

称量EDTA440mg，溴酚蓝25mg，二甲苯青25mg，置于500mL烧杯中，向烧杯中加入去离子水20

mL，加热搅拌充分溶解，加入甘油18mL后，使用NaOH调节PH值至7.0，用去离子水定容至50mL，室温

保存。

4.4染色试剂

4.4.110mg/mL溴化乙锭

2

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称量溴化乙锭0.5g，加入到50ml容器中，加入去离子水50ml，充分搅拌数小时完全溶解溴化乙

锭，将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。

4.4.2凝胶染色液

取10mg/mL溴化乙锭溶液10μL，加入400mL的去离子水，混匀。

5引物

从老芒麦基因组中克隆和鉴定得到的SSR引物见附录B。

6操作步骤

6.1试样制备

青牧1号老芒麦种子单粒发芽成苗。

6.2DNA提取

DNA提取步骤如下：

a)将DNA提取液在65℃水浴中预热。

b)剪取长度为5cm种子幼苗，置于2.0mL的离心管中，加