GB/T 21769-2008 化学品 体外3T3中性红摄取光毒性试验方法

ICS13．300；1I，100

A80园目

中华人民共和国国家标准

21769--2008

GB／T

化学品体外3T3中性红摄取

光毒性试验方法

method

vitroNRUtest

Chemical--In3T3phototoxicity

2008—05—12发布2008—09—01实施

宰瞀髅紫瓣訾矬瞥翼发布中国国家标准化管理委员会“”。

21769--2008

GB／T

刖吾

红摄取光毒性试验》(英文版)。

本标准作了下列编辑性修改：

——增加了范围部分和规范性引用文件部分；

——将OECD简介部分与试验方法原则合并；

——将OECD的试验前须知与试验方法合并；

——删除了OECD的参考文献部分；

——试验结果评价参考了欧盟的试验方法。

本标准的附录A和附录B为资料性附录。

本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC／TC251)提出并归口。

本标准负责起草单位：广东出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：程树军、许崇辉、焦红、温巧玲、潘芳、陈强、秦瑶、黎庆翔。

21769--2008

GB／T

化学品体外3T3中性红摄取

光毒性试验方法

1范围

本标准规定了化学品体外3T3中性红摄取光毒性试验的范围、规范性引用文件、术语和定义、缩略

语、试验基本原则、试验方法、试验结果和试验报告。

本标准适用于化学品潜在光毒性的筛选和检测。本标准可作为化学品光毒性动物试验的替代方法

之一。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有

的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

文版)。

体外中性红摄取光毒性试验》(英

67／548／EEC附录vB．41(2000年)《光毒性

欧盟指令EU

文版)。

3术语和定义、缩略语

3．1术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3．1．1

辐照度irradiance

厘米(mW／cm2)。

3．1．2

of

光剂量doseli【ght

入射到某一表面的紫外线或可见光的量(强度×时间)，单位为焦耳每平方米(J／m2)或焦耳每平方

厘米(J／cm2)。

3．1．3

wavebands

ligllt

紫外线波长UV

denm～

Internationale

国际照明委员会(CIE，Commission

nm～280

400nm)、UVB(280nm～315nm)和UVC(100rim)。其他一些定义也可采用；UVB和

nm，UVA可在340nm处分为UV-A1和UV—A2。

UVA的分界线通常在320

3．1．4

细胞活性cellviability

测量某一细胞群总活性的参数(如细胞溶酶体摄取活性染料中性红)，其数值取决于测定的终点和

试验所用的设计方案，并与细胞总数和／或细胞活力相关。

1

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3．1．5

cell

viability

相对细胞活性relative

通过与溶剂(阴性)对照组的相关性来表达的细胞活性，对照组除了未经受试化学物质处理外，整个

试验过程与试验组一样(或-}Irr或一Irr)。

3．1．6

irritationfactor；PIF

光刺激因子photo

行有效的细胞毒性浓度(IC。。)，通过比较Ics。的值得到的因子。

3．1．7

半数抑制浓度ICso

使细胞活性下降50％的受试化学物质的浓度。

3．1．8

平均光效应meanphotoeffect；MPE

度反应曲线，通过数学分析导出的数值。

3．1．9

光毒性phototoxicity

皮肤第一次接触某种化学物质继而暴露于光下所引发的一种急性毒性反应；或者全身应用一种化

学物质后，暴露于光下所发生的类似皮肤照射的反应。

3．1．10

model

预测模型prediction

将毒性试验结果转换为预测毒性潜力的算法。在本标准中，PIF和MPE可用于把体外3T3中性

红摄取光毒性试验的结果转换为对光毒性潜力的预测。

3．1．11

光刺激性photoirritation

光毒性的亚分类，仅用于描述那些皮肤暴露于化学物质(局部或口服)时产生的光毒性反应。这些

光毒性反应常常导致细胞非特异性损伤(如阳光灼伤)。

3．1．12

光过敏photoallergy

一种获得性免疫反应，皮肤第一次接触化学物质和光线时不产生，要需经过一周或两周的诱导期才

能观察到皮肤反应。

3．1．13

光遗传毒性photogenotoxicity

一种在遗传学水平发生的基因毒性反应，细胞暴露于无遗传毒性剂量的紫外线／可见光和无遗传毒

性的化学物质时诱发的反应。

3．1．14

光致癌性photocarcinogenicity

由于重复使用光线照射和某一化学物质而诱发的致癌性。如果某一化学物具有增强紫外线诱发肿

CO—carcinogenesis)”。

瘤形成的作用，可用术语“光协同致癌作用(photo

3．2缩略语

下列缩略语适用于本标准。

ofPure

3．2．1IUPAC(InternationalUnion

3．2．2NR(Neutral

2

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thylamino-2一methylphenazinehydrochloride)]，CAS编号：553—24—2。

4试验基本原则

光毒性是指应用于机体的物质经暴露于光线后诱发或增强(在低剂量水平时明显)的毒性反应，或

者全身应用一种物质后由皮肤光照引发的反应。体外3T3中性红摄取光毒性试验可以用于鉴定受试

物暴露于光照后由活性化学物质诱导产生的潜在光毒性。本试验通过比较暴露于化学物质的细胞在有

光照和无光照条件下细胞活性相对降低的值评价光细胞毒性，由本试验鉴定的物质很可能具有体内光

毒性，这种作用或者由于全身应用后分布于皮肤产生，或者经局部应用后产生。

本试验方法建立的基础是比较有或无非细胞毒性剂量的刺激性光照射情况下化学品的细胞毒性。

细胞毒性是以受试物在光照射处理24h后，与受试物浓度相关的细胞摄取活体染料中性红的还原量来

表示的。中性红是一种弱的阳离子染料，极易以非离子扩散的方式穿透细胞膜并在细胞溶酶体内聚集。

细胞表面的改变或溶酶体膜敏感性的改变导致溶酶体脆性增高等变化，并逐渐不可逆。这种变化由外

来物质的作用引起，导致细胞吸收和连接NR的能力下降。这样就有可能区分活的、损伤的或死亡的细

胞。这是本试验的基础。

Balb／c

3T3细胞(见5．2．1)经24h培养形成单层。每种受试物用两块96孔培养板，将8个不同浓

度的受试化学物质预培养1h。接着将其中一块培养板暴露于无细胞毒性的最高光照剂量下，另一块

培养板置于暗处。然后两块培养板都用细胞培养基代替处理培养基再培养24h，中性红摄取测定细胞

活性。以占未处理阴性对照组的百分比表示细胞活性，分别计算每一个试验浓度的值。通过比较有光

照和无光照下获得的浓度反应来预测潜在光毒性，通常用Ic；。表示，即与未处理对照相比细胞活性抑制

50％的浓度。

5试验方法

5．1试验前须知

5．1．1光化学特性

许多种类的化学物质能诱导产生光毒性效应，它们的共同特点是在光的波长范围内能够吸收光能

此，在考虑进行生物学试验前，应该按OECD试验指南101的方法先测定受试化学物质的uV／可见光

吸收光谱。如果摩尔消光／吸收系数小于10L×tool_1×cm一，则该化学物质不可能具有光反应性。该

化学物质不必进行本项光毒性试验，或任何其他测定负光化学效应的生物学试验，见附录A。

5．1．2预测范围

对体外3T3中性红摄取光毒性试验的可靠性和相关性的历史评价结果表明，本试验方法能预测动

物和人的体内急性光毒性效应。本试验不能用于预测化学物质与光线联合作用可能产生的其他副效

应，如光基因毒性、光过敏性或光致癌性，也不能用于评价光毒性的毒力大小。此外，本试验也不能阐明

光毒性的间接机制、受试物质的代谢作用或混合作用。

5．1．3新陈代谢系统

尽管新陈代谢系统的使用是所有预测潜在遗传毒性和致癌性体外试验的普遍要求，但迄今为止，在

光毒理学中，无论在体内还是在体外，极少存在化学物质产生光毒素作用需要代谢活动转化的情况。因

此，无需考虑也无科学证据表明本试验方法需要使用新陈代谢活化系统。

5．2试验准备

5．2．1细胞

选用永生化小鼠成纤维细胞系Balb／c3T3，建议细胞株来源于美国典型物质保藏中心(ATCC)或

欧洲细