DB36/T 1415-2021 猕猴桃雌雄种质分子身份证鉴定技术规程

ICS67.080.01

B05

DB36

江西省地方标准

DB36/T1415—2021

猕猴桃雌雄种质分子身份证鉴定技术规程

IdentificationofmaleandfemalegermplasmofActinidiabymolecularidentitycard

2021-06-30发布2022-01-01实施

江西省市场监督管理局发布

DB36/T1415—2021

目次

前言................................................................................II

1范围..............................................................................1

2规范性引用文件....................................................................1

3术语和定义........................................................................1

4原理..............................................................................1

5试剂与试药........................................................................1

6仪器设备..........................................................................1

7操作步骤..........................................................................2

8结果记录与判定....................................................................3

附录A（资料性）主要试剂与试药......................................................5

附录B（资料性）主要仪器设备........................................................7

附录C（规范性）猕猴桃雌性种质特异性引物............................................8

附录D（规范性）猕猴桃雄性种质特异性引物...........................................11

附录E（资料性）67份猕猴桃雌性种质分子身份证......................................14

附录F（资料性）33份猕猴桃雄性种质分子身份证......................................16

I

DB36/T1415—2021

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起

草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本文件由江西省农业农村厅提出并归口。

本文件主要起草单位：江西农业大学。

本文件主要起草人：廖光联、徐小彪、黄春辉、钟敏、贾东峰、曲雪艳、吴茵、涂贵庆、朱壹、魏

清江、辜青青、陈明。

II

DB36/T1415—2021

猕猴桃雌雄种质分子身份证鉴定技术规程

1范围

本文件规定了分子身份证鉴定猕猴桃（Actinidia）雌雄种质的术语和定义、原理、试剂与试药、

仪器设备、检测及构建分子身份证方法。

本文件适用于猕猴桃雌雄种质鉴定与分子身份证构建。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文

件。

NY/T3639中华猕猴桃品种鉴定SSR分子标记法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

分子身份证identitycard

以特异性引物为探针，同猕猴桃细胞核DNA的酶切片段杂交，可以获得由多个位点上的等位基因组

成的长度不等的杂交带，人为将同一位置条带在不同物种上的有无标记为1/0，构建成数字矩阵，同一

物种间极少有两个品种（系）完全相同，故称为特异性分子身份证。

3.2

相似度similarity

供试品种分子身份证与对照分子身份证相似的程度。

4原理

利用CTAB法提取植株叶片DNA，与特异性引物混合后进行PCR仪扩增，并在丙烯酰胺凝胶进行分离和

显现，采用人工读取条带的方式绘制1/0矩阵，构建成DNA分子身份证，最后统计供试品种和对照品种的

相似度，根据相似度鉴别猕猴桃种质的真伪。

5试剂与试药

主要试剂与试药见附录A。

1

DB36/T1415—2021

6仪器设备

主要仪器设备见附录B。

7操作步骤

7.1样品制备

参照NY/T3639执行。

7.2DNA的提取

7.2.1准备工作

水浴锅水浴加热至65℃，预热3%裂解液、洗液，两种液体使用前均需加入2%体积的β-巯基乙醇

（V/V）；-20℃预冷无水乙醇和75%乙醇（现配后预冷）。

7.2.2称样

称取0.10g新鲜/硅胶干燥后的叶片样品于2mL管子，磨样机磨成粉状。

7.2.3第一次洗涤

硅胶干燥后的叶片样品需要进行的步骤。向2mL管子中加入1mL洗液，充分混匀，65℃水浴30

min，中间轻摇数次，使其充分混匀；随后10000rpm/min离心5min。

7.2.4第二次洗涤

硅胶干燥后的叶片样品需要进行的步骤。弃上清液，向2mL管子中加入1mL洗液，充分混匀，65

℃水浴30min，中间轻摇数次，使其充分混匀；随后10000rpm/min离心5min。

7.2.5裂解

弃上清液，向2mL管子中加入1mLCTAB裂解液，充分混匀，65℃水浴1h以上，中间轻摇数次，使

其充分混匀；冷却至室温，随后12000rpm/min离心10min。

7.2.6第一次抽提

取上清液（可0.80mL）于新的2mL管子中，加入等体积抽提液1，摇床混匀10min，随后12000

rpm/min离心10min。

7.2.7第二次抽提

取上清液（可0.60mL）于新的2mL管子中，加入等体积抽提液2，摇床混匀10min，随后12000

rpm/min离心10min。

7.2.8沉淀

取上清液（可0.50mL）于新的1.50mL管子中，加入1/10体积NaAC，2.50倍体积的预冷的无水乙醇，

-20℃沉淀30min以上，随后4℃，10000rrpm/min离心8min。此步骤肉眼可见沉淀。

7.2.9漂洗

2

DB36/T1415—2021

弃上清液，加入1mL75%无水乙醇，沉淀30min。每隔30min漂洗一次，共漂洗4次。

7.2.10干燥

打开盖子放入旋蒸仪，设定DAL模式，30℃，8min，干燥至无液体即可（避免乙醇影响后续PCR），

不可过度干燥。

7.2.11溶解

往每个管子中加入60μLRNA溶解酶（按RNase:TE缓冲液=3μl:1000μl配制）。4℃放置过夜后用

超微分光光度计测定DNA质量。OD260/OD280的值在1.80～2.00时，表明DNA的纯度较好。测定后用TE缓

冲液将DNA含量稀释至150ng/μl。

7.3PCR扩增

7.3.1特异性引物

选用猕猴桃雌雄种质特异性引物（附录C、附录D）进行PCR扩增。

7.3.2扩增反应体系

包含2×TaqPCRMix5μL；上下游引物各0.80μl；模板DNA1μl；双蒸水2.40μl。

7.3.3扩增程序

94℃预变性3min，94℃变性30s，52℃～62℃退火30s，72℃延伸30s，共28个～34个循环，最

后72℃延伸10min于12℃保存。

7.4丙烯酰胺凝胶电泳

7.4.1制胶

按顺序往150mL烧杯加入双蒸水60mL、5XTBE20mL、40%聚丙烯酰胺20mL、APS864μL、TEMED

76μL，搅拌均匀后灌入DNA序列分析电泳仪玻璃板中，排气泡后插入梳齿，凝固1h后进行下一步。

7.4.2点样

拔出梳齿，用移液枪移取1μLPCR扩增产物，点入梳齿孔中；同时点入500bpDNAmarker及10X

LoadingBuffer。

7.4.3跑胶

使用仪器为DYCZ-20G型DNA序列分析电泳仪，先50V电压跑30min，随后调为200V，待10XLoading

Buffer跑到接近玻璃板底部时结束。

7.4.4染色

采用快速银染法，将丙烯酰胺凝胶取下放入硝酸银溶液，浸染10min。

7.4.5显影

从银染液中取出凝胶，用双蒸水冲洗干净后，放入显影液中显影，待条带全部显出，转入到清水

中。

3

DB36/T1415—2021

8结果记录与判定

8.1结果记录

拍照记录并统计清晰的SSR条带，采用人工读带的方法，在MicrosoftExcel中以二进制读带方式记

录引物扩增的结果，同一位点上具有相同迁移率的条带记为1，无带记为0，记录位点位置（见附录E、

附录F）。

8.2构建分子身份证

利用同一样品的不同引物条带读数绘制成1/0矩阵，构建成该品种的特异性分子身份证，如附录

E、附录F所示。

8.3判定

根据相似度进行结果判定，相似度=（同一位点读数相同的数量/总位点数）*100%，相似度等于或

大于99%，即可判定为在分子水平上是同一个样品。

4

DB36/T1415—2021

AA

附录A

（资料性）

主要试剂与试药

A.1试剂

β-巯基乙醇，Tris，HCl，EDTA，NaOH，NaCl，PVP，CTAB，NaAC，无水乙醇，RNA裂解酶，琼脂糖，

DNA核染液，LoadingBuffer，硝酸银，甲醛，Na2CO3，2×TaqPCRMix，硼酸，过硫酸铵，丙烯酰胺，

甲叉丙烯酰胺，TEMED。

A.2配制试剂（灭菌后使用）

A.2.11MTris-HCl

称取12.11gTris，溶于水后定容至100mL，用HCl调节pH为8。

A.2.20.50MEDTA

称取18.61gEDTA，溶于水后定容至100mL，用NaOH调节pH为8。

A.2.3洗液

1.46gNaCl，25mL1MTris-HCl，10mL0.50MEDTA，2gPVP，溶于水后定容至100mL。

A.2.43%裂解液

称取3gCTAB，8.19gNaCl，10mL1MTris-HCl，4mL0.50MEDTA，0.50gPVP，溶于水后

定容至100mL。

A.2.5TE缓冲液

1mL1MTris-HCl，0.20mL0.50MEDTA，溶于水后定容至100mL。

A.2.63mol/LNaAC

称取40.82gNaAC，溶于水后定容至100mL。

A.2.75XTBE

Tris54g，硼酸27.50g，20mLEDTA，定容至1000mL。

A.2.810%过硫酸铵

过硫酸铵1g溶于10mL双蒸水，4℃保存。

A.2.940%聚丙烯酰胺

丙烯酰胺190g，甲叉丙烯酰胺10g，溶解后定容至500mL。

A.2.10银染液

5

DB36/T1415—2021

1g硝酸银溶于1000mL超纯水，定容至1000mL即可，使用前加入2mL甲醛。

A.2.11显影液

20gNaOH，0.40gNa2CO3，溶于1000mL超纯水，定容至1000mL即可。

A.2.12抽提液1

苯酚、氯仿、异戊醇按体积比为苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1配制。

A.2.13抽提液2

氯仿、异戊醇按体积比为氯仿：异戊醇=24:1配制。

6

DB36/T1415—2021

BB

附录B

（资料性）

主要仪器设备

B.1电子分析天平

精确度万分之一。

B.2恒温水浴锅

最高温度100℃。

B.3离心机

最大离心速度12000rpm/min。

B.4超微量紫外分光光度计

最大离心速度12000rpm/min。

B.5PCR仪

常规。

B.6DNA序列分析电泳仪

220V电压。

B.7摇床

最大转速200rpm/min。

B.8旋蒸仪

常规。

7

DB36/T1415—2021

CC

附录C

（规范性）

猕猴桃雌性种质特异性引物

C.1雌性种质特异性引物

雌性种质特异性引物见表C.1。

表C.1雌性种质特异性引物

引物序列退火温度℃等位基因长度(bp)

TGGCGACATGGTCTTCTTAG

2754100～150

TCCAAAGCATGCTCAACTTC

CCAAGCTCATACACCCAATG

3157200～250

AGGTTGGCACTTGGAATAGG

TTCCTTAATCCAGGGTCTCG

5363150～200

ACACAACAGATTGCAGGAGG

GAGTCGGGAGCATAATTGGT

5054250～300

CGCATGGAAGGTCATAACAC

GTGCTCCTCCGTCCATGTAT

UDK97-40864100～150

CGTCCTCTCTTCGCCATTTA

TGGTGTAAAGTCAAAAACAGCC

UDK99-14359100～200

AGAAGATTTCATTGTCCTCCCT

AAGAGCCATAGCTTATTCACCG

UDK96-03560100～150

AAGTAAAGCCATTGTCATTGCA

AACTAAGAAACGGGACCATTG

162150～200

TATGTGGATGTCCCAGAAAAG

CCCCTCATTGTAAAGCATCC

1162150～200

TTGTCACGGGCTTAGAATCC

CCGTCTCAGCAGATGTCACTAT

1552150～200

GCAACTGCCCATAAGATTCC

TACACCTGATGAGATGGACGAC

2254200～250

CCTGTGGCTGATGTTGAAAGT

TCGAGTTACCTAGCTACTCCGC

UDK96-04062