T/CSBM 0044-2023 外周血中循环肿瘤细胞非抗体依赖磁分离检测方法

ICS11.020

CCSC10

T/CSBM

团体标准

T/CSBM0044—2023

外周血中循环肿瘤细胞非抗体依赖磁分离

检测方法

Non-antibody-dependentmagneticseparationdetectionmethodof

circulatingtumorcellsinperipheralblood

2023-12-04发布2024-05-04实施

中国生物材料学会发布

T/CSBM0044—2023

目次

前言................................................................................III

引言.................................................................................IV

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4方法原理...........................................................................2

5检测条件...........................................................................2

6试剂材料和仪器设备.................................................................2

7检测流程...........................................................................2

8样本制备...........................................................................3

血液样本采集...................................................................3

样本前处理.....................................................................3

9样本检测...........................................................................4

检测准备.......................................................................4

CTC磁分离捕获..................................................................4

细胞制片.......................................................................5

CTC鉴定........................................................................5

10测定结果有效性判定................................................................7

细胞病理鉴定法................................................................7

免疫细胞化学和免疫荧光法......................................................8

荧光原位杂交法................................................................8

逆转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）..............................................8

基因测序法....................................................................9

11测定结果..........................................................................9

测定结果表述..................................................................9

测定结果使用.................................................................10

12注意事项.........................................................................10

安全管理.....................................................................10

试剂材料防污染...............................................................10

废弃物处理...................................................................10

附录A（规范性）试剂材料和仪器设备..................................................11

A.1试剂材料......................................................................11

A.2试剂配制方法..................................................................11

A.3仪器设备......................................................................12

A.4各检测阶段试剂材料和仪器设备..................................................12

附录B（资料性）CTC磁分离检测操作..................................................14

I

T/CSBM0044—2023

B.1样本前处理....................................................................14

B.2CTC捕获探针准备...............................................................14

B.3涂片放置......................................................................15

B.4CTC染色鉴定...................................................................16

B.5采图操作......................................................................16

附录C（资料性）膜过滤法............................................................17

C.1方法原理......................................................................17

C.2试剂材料及仪器设备............................................................17

C.3操作步骤......................................................................17

附录D（资料性）微流控芯片法........................................................18

D.1方法原理......................................................................18

D.2试剂材料及仪器设备............................................................18

D.3操作步骤......................................................................18

附录E（资料性）荧光原位杂交探针....................................................19

附录F（资料性）逆转录聚合酶链式反应靶点............................................20

附录G（资料性）基因测序类别........................................................22

参考文献.............................................................................23

II

T/CSBM0044—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中国生物材料学会提出。

本文件由中国生物材料学会团体标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：致慧医疗科技（上海）有限公司、福建省致慧医疗科技有限公司、同济大学、同

济大学附属东方医院、上海市第十人民医院、吉林大学第一医院、北京麦斯达夫科技股份有限公司。

本文件主要起草人：陈炳地、刘中民、乐文俊、高金莉、孙奋勇、董春燕、许建成、张惠棋、郑波。

III

T/CSBM0044—2023

引言

本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到《一种非抗体依赖的循环肿瘤细胞检

测方法》（专利号：202111189852.6）相关的专利的使用。

本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。

该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，

就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联

系方式获得：

专利持有人姓名：福建省致慧医疗科技有限公司。

地址：福建省泉州市晋江市罗山街道世纪大道南段3001号三创园A区105号。

请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责

任。

IV

T/CSBM0044—2023

外周血中循环肿瘤细胞非抗体依赖磁分离检测方法

重要提示：使用本文件的人员具备实验室工作经验十分重要。本文件并未指出所有可能的安全问题。

使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本文件规定了方法原理、检测条件、试剂材料和仪器设备、检测流程、样本制备、样本检测、测定

结果有效性判定、测定结果和注意事项。

本文件适用于外周血液循环肿瘤细胞的非抗体依赖磁分离检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

外周血peripheralblood

位于体表或肢体表面大血管的终末分支中的血液。主要指组织内的小动脉和与组织发生物质交换的

毛细血管内的血液。

循环肿瘤细胞CirculatingTumorCell（CTC）

从原发肿瘤脱落并在血液中循环的细胞，其转移和继发与肿瘤的形成、癌症相关死亡密切相关。

循环肿瘤细胞捕获探针CTCcaptureprobe

可识别循环肿瘤细胞并使其被高效富集的材料。

注：本文件中特指根据非抗体依赖的循环肿瘤细胞的捕获技术原理设计而成的细胞捕获探针。

密度梯度离心densitygradientcentrifugation

用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通

过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离的方法。

免疫细胞化学immunohistochemistry

利用抗原与抗体特异性结合的原理，以标记抗体作为探针来显示细胞内抗原成分，主要是多肽与蛋

白质（包括受体、酶、分泌物前体等各种基因表达产物），对其进行定位、定性及定量的研究。

1

T/CSBM0044—2023

免疫荧光immunofluorescence

用荧光素标记抗体（或抗原），检测相应抗原（或抗体）的免疫标记技术。

荧光原位杂交fluorescenceinsituhybridization（FISH）

一种非放射性原位杂交技术。将变性后的标记核苷酸探针（包括直接与荧光素结合的直接标记探针；

用生物素、地高辛等标记的间接标记探针）与变性后的染色体、细胞、组织中的核酸按照碱基互补配对

原则进行杂交，经洗脱后直接分析或通过免疫荧光系统检测，最后在荧光显微镜下观察。

逆转录聚合酶链式反应reversetranscription-polymerasechainreaction（RT-PCR）

先将RNA通过逆转录酶的作用合成与之互补的DNA链，再以该链作模板进行聚合酶链反应扩增特定

RNA序列的方法。

基因测序genesequencing

分析特定DNA片段的碱基序列，即腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）的排

列方式。

4方法原理

基于CTC和血球细胞之间的特性差异，利用非抗体依赖的方法捕获CTC并通过细胞染色、免疫细

胞化学、荧光原位杂交或逆转录聚合酶链式反应法对捕获细胞进行分析鉴定。

非抗体依赖的方法包括无标记捕获探针法（见9.2.1）、多肽捕获探针法（见9.2.2）、膜过滤法

（见附录C）和微流控芯片法（见附录D）等。非抗体依赖磁分离方法包括但不限于以下两种：

——无标记捕获探针法：CTC在一定密度梯度介质中通过离心力进行分层分离后，利用无标记的顺

磁性纳米磁性微粒捕获CTC，并在外加磁场的作用下实现CTC与其他血液成分有效分离和富集；

——多肽捕获探针法：利用多肽修饰的磁性微粒捕获外周血中的CTC，多肽捕获探针与外周血中的

CTC稳定结合，并在外加磁场的作用下实现CTC与其他血液成分有效分离和富集。

5检测条件

检测条件如下：

——温度：25℃±5℃；

——相对湿度：30％～65％；

——压强：标准大气压。

6试剂材料和仪器设备

试剂材料和仪器设备应符合附录A的要求。

7检测流程

外周血中CTC检测流程见图1。

2

T/CSBM0044—2023

样品制备

血液样本采集→样品前处理

样本检测

检测准备→CTC捕获→细胞制片→CTC染色鉴定

测定结果

测定结果有效性判定和表述

图1外周血中CTC检测流程图

CTC磁分离检测操作见附录B。

8样本制备

血液样本采集

8.1.1采血前准备肝素/EDTA-K2真空抗凝管。

8.1.2采血量宜为4mL～15mL，采血收集完毕后，应立即颠倒混匀采血管不少于5次，不宜剧烈震荡，

产生气泡。

8.1.3血样应在4℃～8℃环境下保存，72h内进行CTC检测。

样本前处理

8.2.1密度梯度离心法

离心前检查血样，无溶血、凝块即为合格样本。

将细胞密度梯度分离液置于37℃水浴预热15min。水浴锅水位应高于样本液面，确保容器内

样本达到目标温度。

预热后依次加入15mL离心管中。

手握采血管两端，轻缓180°翻转采血管8次～10次，充分混匀外周血样本。

取1mL混匀的血样，按照1:3比例加入3mL1×PBS稀释，用吸管将稀释后的血液缓缓加入

密度梯度分离液上层。

注：PBS为磷酸缓冲盐溶液（PhosphateBufferedSaline）。

放置离心机中400g～450g，离心30min～40min。

离心后分层界面清晰，离心后溶液分为3层：上层为血浆层，中层为白膜层，下层为红细胞

层。中层为目的细胞收集层，目的细胞层中间有以单个核细胞为主的白膜带，目的细胞截留率＞85％。

3

T/CSBM0044—2023

用吸管去除上层血浆后，再将中层目的细胞收集层（2.5mL～6.5mL之间）全部转移至15mL

离心管中，加入PBS定容至12mL，盖紧管盖，轻缓180°翻转离心管数次，放置于离心机中300g～350

g，离心5min～7min。

离心后，保留底部约100g液体。加入适量PBS重悬细胞。

8.2.2红细胞裂解法

取样：宜在4℃条件下操作，取1mL新鲜抗凝血于离心管中。

裂解：按照1:3比例在离心管中加入3mL1×红细胞裂解液，裂解5min。

离心：在室温下，500g离心5min，弃红色上清液。

二次裂解离心：若发现红细胞裂解不完全，可以重复裂解（见）和离心（见）

一次。

洗涤：加入适量1×PBS，轻柔混匀重悬沉淀，在室温下，500g离心5min。

沉淀：离心后去除上清液，用适量1×PBS重悬沉淀细胞。

9样本检测

检测准备

9.1.1CTC捕获探针活化和分散性评估

用镊子夹住管壁，离心管倾斜45°，打开超声清洗仪，左右激烈晃动，保持1min以上。

取2L活化后的CTC捕获探针均匀铺在载玻片上，肉眼观察无明显沉淀与絮状物。

必要时于显微镜下观察，要求能均匀分散为细小粒子悬浮于分散介质中而不沉淀、不抱团，

CTC捕获探针活化完成。

注1：活化是减少材料团聚，提升材料反应活性，对材料进行化学处理改善材料分散性的处理过程。

注2：分散性指材料在水或其他均匀液体介质中，能均匀分散为细小粒子悬浮于分散介质中而不沉淀的性能。

注3：分散性评估指用超声清洗仪充分超声分散探针，取少量用粒径分析仪检测探针的粒径分布，其中多分散指数

（PolydispersityIndex，PDI）≤0.3，说明分散性良好。

9.1.2涂片放置

进行离心涂片前按“载玻片+滤纸+涂片漏斗”的顺序依次对齐放置，涂片漏斗孔和滤纸孔对齐；在

涂片机上按载玻片正面贴紧滤纸，光滑面朝外的方式夹紧，应无缝隙。

CTC磁分离捕获

9.2.1无标记捕获探针法

将洗涤后的细胞沉淀用少量PBS重悬在1.5mL离心管中，定容至1mL。

取适量磁性纳米探针加入1.5mL离心管中。

将加有磁性纳米探针的离心管放置于迷你旋转培养器上，在4℃条件下混匀6min～8min。

取出离心管后立即置于多功能磁分离器上，在4℃条件下磁吸附6min～8min。

注：磁吸附为磁性材料在外加磁