T/SAIA 001-2021 柴胡种子DNA分子鉴定规程

范围:本文件规定了柴胡种子DNA分子鉴定的实时荧光PCR技术原理方法和操作规程。 本文件适用鉴定中药材北柴胡和狭叶柴胡种子的真实性; 主要技术内容:基于实时荧光PCR技术，建立多重实时荧光PCR检测体系，采用DNA条形码中的ITS基因序列为靶基因，设计柴胡的通用引物与探针以及狭叶柴胡和北柴胡的特异性引物和探针，通过对荧光聚合酶链式反应反应体系和反应条件的优化筛选，建立了多重实时荧光聚合酶链式反应方法，在同一聚合酶链式反应反应体系中可以同时鉴别狭叶柴胡、北柴胡种子的源性成分。DNA提取：每份材料混合取0.3g，用灭菌后的研钵在液氮状态下研磨成粉末。将含有2%β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液置于65℃水浴锅中预热；将研磨好的样品取0.15g置于2.0mL的离心管中；加入700μL 65℃预热的CTAB提取缓冲液，65℃保温30 min，期间摇动3-4次；加入700μL氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒使其充分混匀，12000r/min离心10min，吸取上清液转移至另一个离心管中；将上清液转移到新的离心管中，加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，将其充分混匀，置于-20℃ 30 min或过夜，12000r/min离心15 min，收集沉淀；加入700 μL 70%无水乙醇漂洗，12000r/min离心2min，弃掉上清液，此步骤重复一遍；室温下或超净工作台中自然风干DNA5-10 min；加入50 μL的双蒸水或TE缓冲液，涡旋振荡充分混匀，12000r/min离心2 min，4℃保存备用或置于-20℃保存